O microscópio de força atômica (AFM), desde sua criação em 1986, tem desempenhado um papel cada vez mais importante em estudos básicos em áreas como biologia e medicina. Em estudos iniciais foi possível evidenciar a visualização e caracterização de moléculas biológicas. No entanto, à medida que as técnicas de AFM foram se aperfeiçoando, tanto células fixas como células vivas começaram a ser estudadas, o que também resultou em aplicações na área de microbiologia e, posteriormente, estudos de parasitos de importância médica (DVORAK et al., 2000).
DE SOUZA, W.; ROCHA, M.G. (2011) aponta sobre as modalidades do uso do AFM, que tem sido usado tanto para obter imagens, como também para medir forças, elasticidade, hidrofobicidade e carga, e ainda para identificar receptores ou ligantes específicos e para caracterizar algumas de suas propriedades físico-químicas, tendo sido aplicado ao estudo de organização estrutural de tripanosomatídeos, com as primeiras tentativas realizadas por Dvorak e colaboradores, no entanto, as imagens publicadas não adicionaram novas informações significativas sobre tripanosomatídeos. Entretanto, tem sido utilizada uma metodologia similar à de microscopia eletrônica, como também introduzindo pré-tratamento dos protozoários com detergente, em que tanto a superfície celular quanto as estruturas intracelulares de formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi foram bem reconhecidas.
ROCHA, G. M. et al. (2008) relata algumas caraterísticas do AFM que o tornam uma ferramenta atraente para obter informações estruturais que complementam aquelas obtidas por microscopia eletrônica, como a aquisição e interpretação de dimensões tridimensionais em formação. Pode-se trabalhar em condições secas ou úmidas, entretanto, não possui necessidade de operar em alto vácuo, apresenta uma ausência de efeitos de carga e revestimento de metal que geralmente se faz presente em amostras preparadas para MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura), o que tem sido relatado como uma das diferenças de resolução entre o MEV e o AFM. No entanto, o AFM apresenta algumas limitações que incluem a aquisição de imagens de baixa velocidade (a microscopia eletrônica, geralmente é mais rápida), campo de visão restrito quando não está associado a outras modalidades de microscopia e métodos de preparação de amostras limitados e não padronizados, quando comparados a métodos de microscopia eletrônica.
As imagens feitas por microscopia óptica mostram a diferença da quantidade de parasitos dispostos nas lamínulas a partir do procedimento utilizado, quando não agitadas em vórtex e quando agitadas em vórtex, conforme a Figura 15. Quando não agitados em vórtex,
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nota-se a formação de aglomerados de parasitos na lamínula, o que dificulta a obtenção de imagem de parasitos no AFM, quando agitadas em vórtex, a formação de aglomerados diminui, o que contribui para a obtenção de imagens no AFM.
Figura 15 – Microscopia óptica de grupo controle (não tratado) de formas epimastigotas de T. cruzi quando não agitadas em vórtex (A) e quando agitada em vórtex (B)
A B
Fonte: elaborado pelo autor.
A partir dessa informação foi sendo realizada agitação em vórtex para todas as amostras.
Quando se utiliza o protocolo com séries hidroalcoólicas, nota-se que a concentração de parasitos diminui quando dispostos na lamínula, conforme as Figuras 16 e 17. Isso pode ocorrer devido à quantidade de centrifugações realizadas conforme o protocolo utilizado referente ao MEV (LIMA et al., 2016), o que também dificulta a obter imagens por meio do AFM. Ao reduzir as lavagens, nota-se grande quantidade de parasitos dispostos na lamínula, e isto facilitou a obtenção de imagens por meio do AFM, sem a necessidade de realizar lavagens hidroalcoólicas, utilizando apenas glutaraldeído como fixador e lavagens com PBS e água, e isto sem causar danos ao equipamento, por se tratar de material biológico. Através deste procedimento, pode-se então obter imagens de vários parasitos em um mesmo campo de visão, podendo assim facilitar estudos de parasitos tratados com fármacos a serem testados.
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Figura 16 - Microscopia óptica de grupo controle (não tratado) de formas epimastigotas de T. cruzi quando utilizado o protocolo para MEV (lavagens hidroalcoólicas) em A e quando utilizado o protocolo para AFM (sem lavagens hidroalcoólicas) em B
A B
Fonte: Elaborado pelo autor.
Figura 17 - Microscopia óptica de formas epimastigotas de T. cruzi tratado com BZN quando utilizado o protocolo para MEV (lavagens hidroalcoólicas) em A e quando utilizado o protocolo para AFM (sem lavagens hidroalcoólicas) em B
A B
Fonte: Elaborado pelo autor.
Com a utilização de membranas de nitrocelulose em vez de lamínulas, não foi possível a visualização de parasitos com este método, porém, pode ser pelo fato de essas membranas adquiridas não serem de boa qualidade e também não serem completamente lisas, apresentando irregularidades em sua superfície (dados não mostrados).
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materiais biológicos por AFM, como mostrado por SANTOS et al. (2008) com imagens de biofilme de Enterococcus faecalis, utilizando membranas de nitrocelulose de poro de 0,22 µm e 13 mm de diâmetro da marca Millipore, onde se obtiveram imagens de biofilme por AFM em diferentes estágios de desenvolvimento.
Com as imagens realizadas utilizando o processo de desidratação puderam-se observar danos em sua estrutura, como relatado por DVORAK et al. (2000), em que a fixação com glutaraldeído e a desidratação com etanol não eram adequadas para a preservação da superfície topográfica de todas espécies de protozoários, como em T. cruzi, Entamoeba histolytica e Toxoplasma gondii, porque suas superfícies se encontraram mal preservadas, exibindo também artefatos de encolhimento e ruptura, o que corrobora com nossos resultados, conforme as Figuras 18,19 e 20.
Figura 18 - Imagens de AFM da forma epimastigota de T. cruzi sem tratamento (grupo controle) com resolução de 21µm, observada no formato 3D
Fonte: Elaborado pelo autor.
Em imagens de topografia (à esquerda) notam-se alterações na estrutura do parasita em áreas mais claras, e em imagens de fase (à direita) são mostradas características de elasticidade e composição mais rígida da membrana.
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Figura 19 - Imagens de AFM da forma epimastigota de T. cruzi sem tratamento (grupo controle) com resolução de 5 µm, observadas no formato 3D, na região próxima aos microtúbulos subpeliculares
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nessa imagem pode-se observar o aparecimento de fissuras na região próxima aos microtúbulos subpeculiares (cabeça do parasito), o que pode estar associado ao processo de desidratação, ao passar por uma série hidroalcoólica conforme o protocolo utilizado para realizar imagens no MEV. Em imagem de topografia (à esquerda) são mostradas diferenças de altura, em áreas mais claras observam-se regiões mais altas, e em imagens de fase e de altura juntas (à direita) são mostradas diferenças em termos de elasticidade da membrana, em áreas mais claras a membrana se encontra menos rígida.
Figura 20 - Imagens da forma epimastigota de T. cruzi, sem tratamento (grupo controle), na resolução de 21µm
Fonte: Elaborado pelo autor.
Notam-se alterações estruturais, características da superfície e alteração mecânica na membrana.
As Figuras 21, 22 e 23 mostram detalhes da superfície do parasito sem tratamento, porém podem-se observar alterações na superfície da membrana quando passada pelo processo de desidratação. No entanto, em preparação de amostras biológicas é relatado na literatura o processo de fixação e desidratação para Microscopia Eletrônica de Varredura
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(CASTRO, 2002; DEDAVID, GOMES, MACHADO, 2007; GROSS, PIRES, FERNANDES, 2014b), porém, para Microscopia de Força Atômica (AFM), um dos maiores problemas é a preparação de amostras, principalmente para estudo de parasitos, em que devem permanecer hidratados com um meio fisiologicamente apropriado se forem estudados em seu estado nativo, e isto se torna possível com uma configuração especializada do AFM, conforme DVORAK et al. (2000), daí a importância de se estudar novas metodologias de preparo de amostras.
Figura 21 - Imagens de AFM da forma epimastigota de T. cruzi (grupo controle), mas que passou pelo processo de desidratação como parte do processo de preparo de amostras para análise em microscopia eletrônica. Imagens de topografia (à direita) e imagens de fase (à esquerda)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nessa imagem nota-se em (a), em imagem de topografia (à esquerda), que não há diferaça de altura, porém, em imagem de fase (à direita), nota-se uma alteração na estrutura do parasita, o que pode ter sido provocado pelo processo de centrifugações, provocando danos na estrutura do parasita, o que pode mascarar resultados, quando obtidas imagens de parasitas tratados usando este procedimento.
Figura 22 – Imagens topográficas em 3D (esquerda) e gráficos de perfil (direita) no plano formado pelos segmentos P e Q
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Na imagem de topografia (à esquerda) mostra uma pequena perda de material celular nas regiões P e Q, e o gráfico de perfil (à direita, gráfico acima) não mostra diferenças de altura. Já o gráfico de perfil (à direita, parte de baixo) mostra variação na composição química em imagem de fase, sendo um detalhe que em imagens de MEV não é mostrado. Figura 23 - Imagem de topografia (altura)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Imagem de topografia, na qual se nota a presença de fissuras ocasionadas pelo excesso de centrifugações durante o processo de desidratação do parasita.
LOGRADO (2009) afirma que por meio do AFM é possível a aquisição de imagens topográficas de sistemas biológicos sob variadas condições. A visualização dessas imagens, por si só, já fornece muitas informações de natureza morfológica. Porém, há possibilidade de manipular o equipamento em diferentes modos de operação, onde cada um avalia de modo diferente a interação sonda-amostra, permitindo assim a obtenção de uma variedade maior de informações, como adesão, rigidez e elasticidade, o que aumenta a possibilidade de informações fornecidas pelo método, como mostram na Figura 24 imagens de T. cruzi sem tratamento com BZN, imagens de topografia e imagens de fase mostrando características da superfície.
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Figura 24 - Imagens de AFM da forma epimastigota de T. cruzi (grupo controle) e com preparação em glutaraldeído e sem lavagens em série hidroalcoólica. Em (a) imagens de topografia (altura) em (b) imagens de fase
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nas imagens de topografia em (a) os parasitos mantêm uma mesma altura, apresentando características de uniformidade. Em (b) são mostradas propriedades da membrana mais uniforme, com diferenças em sua elasticidade.
SEGUEL et al. (2016) relata que, apesar do uso do BZN por mais de 50 anos, apenas em 2015 foi publicado o primeiro ensaio clínico randomizado com o intuito de avaliar sua segurança e eficácia, contudo, não obtiveram resultados favoráveis quanto à eficácia do BZN com relação aos desfechos primários da doença. Neste trabalho foram realizadas imagens em AFM mostrando o efeito do BZN em epimastigotas de T. cruzi. Na Figura 25, é mostrado o aumento da rugosidade no corpo do parasito causado pelo tratamento com BZN em imagens de topografia e em imagens de fase, contudo, o BZN, apesar de ser um fármaco efetivo para doença de Chagas, tem apresentado efeitos colaterais indesejados que podem levar à interrupção do tratamento, apresentando-se também como genotóxico e podendo
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apresentar-se como carcinogênico (TROCHINE et al., 2014).
Figura 25 - Imagem de AFM de T. cruzi tratado com BZN com a CI50 de 56,7 µL/mLe com
preparação em glutaraldeído e sem lavagem em série hidroalcoólica. Em (a) imagens de topografia e em (b) imagens de fase
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nessa imagem podem-se notar um aumento na rugosidade e alterações na superfície da forma epimastigota de T. cruzi, após passar por tratamento com BZN. Em (a), em imagens de topografia, notam-se alterações na superfície em áreas mais claras, e em (b), em imagens de fase, nota-se uma deformação no corpo do parasito com o aumento da rugosidade.
A Fig.26 mostra imagens topográficas de parasitos tratados e não tratados com BZN, onde aparecem alterações nas propriedades da superfície provocadas pela ação do medicamento. Tessarolo (2016) mostra, em ensaios de determinação de mecanismo de morte celular realizados com BZN (56,7µg/mL) e analisados em citometria de fluxo utilizando marcadores de fluorescência 7-amino actinomicina D (7-AAD) e anexina V-ficoeritrina (Anexina V-PE), que foi observado um aumento de marcação por 7-AAD, sugerindo morte celular por necrose. Esse mecanismo é comumente caracterizado por um aumento rápido de
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volume citoplasmático, colapso de organelas e ruptura de membranas.
Figura 26 - Imagens topográficas em 3D (esquerda) e gráficos de perfil (direita) no plano formado pelos segmentos P e Q de parasitos não tratados (grupo controle) em (a) e parasitos tratados com a CI50 do BZN 56,7µL/mL em (b)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nessa figura, nota-se que, em formas epimastigotas não tratados (em a), a superfície apresenta-se de forma uniforme, sem danos em sua estrutura, como é mostrado no gráfico de perfil de altura, exibindo também elasticidade não intacta em gráfico de perfil de imagem de fase.
Porém, nos parasitas tratados com BZN (em b), pode-se notar que as regiões P e Q apresentam perda de material celular devido à ação do fármaco, diferenças de altura, com o gráfico de perfil de altura mostrando uma superfície não uniforme, demonstrando danos em sua estrutura. Contudo, em gráfico de perfil de imagem de fase, é mostrada variação em sua composição química.
Neste trabalho, as Figuras 27 e 28 mostram detalhes da superfície da cabeça do parasita e do flagelo tratados e não tratados com BZN, podendo-se observar na Figura 27 um aumento da rugosidade e formação de fissuras na membrana, quando tratados com BZN, e na Figura 28, a presença de poros na superfície do flagelo, quando tratados com BZN. O flagelo dos tripanosomatídeos está envolvido em pelo menos dois processos biológicos, que são o movimento da célula e a ligação do protozoário à superfície das células do hospedeiro vertebrado e às membranas perimicrovilares que revestem o intestino do hospedeiro vertebrado (DE SOUZA,W.,1999).
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Figura 27 - Detalhes em alta resolução da superfície da cabeça do T. cruzi (grupo controle) em (a) e tratado com a CI50 do BZN 56,7µL/mL em (b)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Nessa figura nota-se em (a) a superfície da cabeça da forma epismatigota não tratada, apresentando-se de forma mais lisa e regular ; quando tratada com BZN em (b), notam-se alterações na superfície e formação de fissuras na membrana devido à ação do medicamento.
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Figura 28 - Imagens de AFM da cauda do T. cruzi (grupo controle) em (a) e tratada com a CI50
do BZN 56,7µL/mL em (b)
Fonte: Elaborado pelo autor.
Pode-se observar a estrutura do flagelo da forma epimastigota de T. cruzi, quando não tratado em (a), mostrando uma superfície lisa e uniforme, enquanto que o parasita epimastigota tratado com BZN em (b) apresentou poros em sua superfície, e isso pode ter sido obtido por conta do tratamento com BZN que provocou danos na superfície do flagelo.
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CONCLUSÃO
O método de preparo de amostras sem as lavagens hidroalcoólicas possibilitou visualizar maiores quantidades de parasitos dispostos na lamínula e também sem a presença de parasitos aglomerados, o que facilita a visualização de parasitos através do AFM, quando comparado com o método utilizado de lavagens hidroalcoólicas, em que, além de a quantidade de parasitos dispostos na lamínula ser pequena, o método de desidratação causa prejuízos à estrutura do parasito, podendo mascarar resultados quando tratados com algum fármaco a ser testado.
Foi possível também a obtenção de imagens de AFM de formas epimastigotas tratadas com BZN e visualizar os danos causados na estrutura do parasito pela ação do fármaco, podendo assim ser utilizado esse mesmo método para investigar novos alvos terapêuticos para tratamento de doença de Chagas.
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REFERÊNCIAS
ADADE, C. M.; SOUTO-PADRÓN, T. Contributions of Ultrastructural Studies to the Cell Biology of Trypanosomatids : Targets for Anti-Parasitic Drugs. The Open Parasitology Journal, v. 4, p. 178–187, 2010.
BALDANI, V.L.D et al. (Rio de Janeiro). Técnicas Microscópicas Aplicadas Na
Identificação E Localização De Bactérias Fixadoras De Nitrogênio E Biomacromoléculas Em Tecidos Vegetais. Rio de Janeiro: Embrapa Agrobiologia, 1998. 27 p. Disponível em: <https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/CNPAB-2010/27241/1/doc050.pdf>. Acesso em: 08 dez. 2016.
BINNIG, G.; ROHRER, H.. In touch with atoms. Reviews Of Modern Physics, v. 71, n. 2, p.324-330, mar. 1999.
BRASIL Ministério da Saúde. Secretaria Guia de Vigilância Epidemiológica | Caderno 10 Secretaria de Vigilância em Saúde /MS 2009a.
BRENER, Zigman. Typanosoma cruzi: morfologia e ciclo evolutivo. In: DIAS, J.C.P; COURA,JR(Org.). Clínica e terapêutica da doença de Chagas: uma abordagem prática para o clínico geral [online]. Rio de Janeiro: Fiocruz, 1997. p. 25-31. Disponível em:
<http://books.scielo.org/id/nf9bn/pdf/dias-9788575412435-03.pdf>. Acesso em: 23 ago. 2016. CAMARGO, E. . Growth and Differentiation in Trypanosoma Cruzi. I. Origin of Metacyclic Trypanosomes in LiquidMedia. Rev do inst de medicina tropical de são paulo, v. 6, p. 93– 100, 1964.
CASTRO, Luis Antônio Suita de. Processamento de Amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura. 2002. Disponível em:
<https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/744135/1/documento93.pdf>. Acesso em: 24 nov. 2016.
CEVEY, Á. C.; Mirkin, GA.; Penas, FN. ; Goren, NB. Low-dose benznidazole treatment results in parasite clearance and attenuates heart inflammatory reaction in an experimental model of infection with a highly virulent Trypanosoma cruzi strain. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance, v. 6, n. 1, p. 12–22, 2016.
CONITEC (Org.). ESCOPO - PROTOCOLO CLÍNICO E DIRETRIZES
TERAPÊUTICAS - DOENÇA DE CHAGAS - ABRIL/2016. 2016. Disponível em:
<http://conitec.gov.br/images/Relatorios/2016/PropostaEscopo_PCDT_DoencaChagas.pdf.>. Acesso em: 10 out. 2016.
DE SOUZA, W. A Short Review on the Morphology of Trypanosoma cruzi: From 1909 to 1999. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 94, n. SUPPL. 1, p. 17–36, 1999.
DE SOUZA, W. Structural organization of Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 104 Suppl, n. May, p. 89–100, 2009.
DE SOUZA, W.; ROCHA, G. M. Atomic force microscopy: A tool to analyze the structural organization of pathogenic protozoa.Trends in Parasitology, 2011.
50
DE SOUZA, Wanderley de; ROCHA, Gustavo M.. Atomic force microscopy: a tool to analyze the structural organization of pathogenic protozoa. Trends In Parasitology, [s.l.], v. 27, n. 4, p.160-167, abr. 2011. Elsevier BV. http://dx.doi.org/10.1016/j.pt.2010.12.010. DEDAVID, B. A.; GOMES, C. I.; MACHADO, G. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA - Aplicações e preparação de amostras - Materiais Poliméricos, metálicos e semicondutores. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP), p. 60, 2007. DUARTE, Fabiano Carvalho. TUNELAMENTO COM VARREDURA ( STM ) E
MICROSCÓPIO DE FORÇA ATÔMICA (AFM) MATÉRIA: IE 607 A - MEDIDAS