Os resultados apresentados nesta seção serão expostos de acordo com a ordem apresentada nos objetivos específicos apresentados na secção anterior. Muitos dos resultados aqui apresentados foram publicados este ano na revista Molecular Biosystems (anexo a esta tese), e é importante frisar que a obtenção destes resultados contou com a valiosa contribuição científica dos demais autores, principalmente do Dr. Daniel Maragno Trindade.
3.1 - Desenvolvimento de um kit diagnóstico visando a identificação da proteína STC1 em soro de pacientes com leucemia.
Os dados previamente obtidos por ensaio de microarranjos de DNA (Tabela 1), que mostraram um aumento na expressão de STC1 em BMEC após o tratamento com plasma de pacientes com LLA em cerca de 8 vezes, forneceram mais uma evidência do que já era sugerido pela a literatura científica (Tohmyia Y, et al., 2004) e por uma patente (JP/2000/002709): o potencial uso de STC1 como um biomarcador para microambiente tumoral leucêmico.
Nós fomos capazes de confirmar o aumento da expressão do mRNA de STC1 durante a co-cultura de células do estroma da medula óssea com blastos leucêmicos por PCR em Tempo Real (primers utilizados e maiores detalhes ± Tabela 2 e materiais e métodos), e observamos um aumento semelhante (cerca de 7x) ao encontrado por microrranjo, em células estromais co-cultivadas com células primárias de LLA de 3 diferentes pacientes, após 24 horas de tratamento (Figura 9).
Tabela 2. Sequência de primers e concentrações usadas no PCR em Tempo Real Quantitativo (Santos, MT,et al., 2011)
Figura 9. Análise de genes candidatos por PCR em Tempo Real Quantitativo. (A) Células estromais da medula óssea foram cultivadas até atingirem a confluência e posteriormente submetidas a co-cultura com células primárias precursoras-B de leucemia linfoblástica aguda, obtidas de diferentes paciente para os períodos de tempo indicados. As células estromais da medula óssea foram separadas e processadas para extração de RNA, sintese de cDNA e PCR em Tempo Real Quantitativo. (B) Expressão do mRNA de diferentes genes candidatos em células estromais da medula óssea , cultivadas em meio fresco sem Soro Fetal Bovino (BFS ± bovine fetal serum) durante 6 horas e 24 horas (ambos com e sem BFS), ou estimulados pela co-cultura com blastos leucêmicos primários de três diferentes pacientes com LLA (amostras 1, 2 e 3) em meio fresco sem BFS. As mesmas amostras de células estromais da medula óssea antes do co-cultivo (0h) foram usadas para calibração (set para 1.0). As barras indicam o erro padrão com 95% de confidência. DKK1 e STC1 apresentaram inicialmente uma diminuição nos níveis de expressão, após 6 horas de co-cultura. STC1 demonstrou, após 24 horas, um grande aumento em seu nível de expressão, validando assim os dados de microarranjo e sugerindo que STC1 sirva de fato como um marcador do microambiente tumoral da leucemia. (Santos MT, et al., 2011).
Este dado nos encorajou a estudar STC1 como provável e potencial biomarcador oncológico para leucemia visto que até hoje, nenhum trabalho mostra a tentativa de se identificar níveis diferenciais da proteína Stanniocalcina-1 no soro de pacientes com leucemia. Além do fato de ser possível identificar a expressão do mRNA de STC1 em soro de pacientes com leucemia (Tohmyia Y, et al., 2004; JP/2000/002709) e de STC1 ser uma proteína sabidamente secretada para o meio extracelular (Barlet JP, et al., 1998), outras evidências nos levaram a acreditar que seja possível também encontrar a proteína
no plasma destes pacientes: Em 2002, Paciga e seus colaboradores, publicaram um estudo de STC-1 em ratos e observaram a presença da proteína no soro, quando as fêmeas estavam em período de gestação e lactação, demonstrando a capacidade da proteína STC-1 transpor a membrana celular e entrar na corrente circulatória. No caso de câncer de ovário, foram identificadas quantidades da proteína STC1 no soro de pacientes significantemente maiores do que no soro de voluntários saudáveis (Liu G, et al., 2010).
Desta forma iniciamos o desenvolvimento de um kit diagnóstico, que visa identificar níveis diferenciais da proteína STC1 em soro de pacientes com leucemia quando comparado ao soro de voluntários saudáveis, através da técnica de ELISA sanduiche.
O primeiro passo foi a produção de anticorpos monoclonais anti-STC1. Como a intenção é realizar o ensaio por ELISA sanduiche, fez-se necessário desenhar uma estratégia que identificasse anticorpos monoclonais reativos a diferentes epítopos (determinantes).
A estratégia inicial consistia em utilizar a proteína recombinante STC1 full lenght para imunizar os camundongos, e utilizar as construções truncadas, STC1 Cterminal e STC1 Nterminal para selecionar os diferentes clones de anticorpos, garantindo assim a identificação de clones que sejam reativos a diferentes epítopos. A truncagem da proteína em regiões C- e N terminais, visou respeitar a formação das pontes dissulfeto internas, de modo que não se separasse nenhum par de cisteínas (Figura 10 A).
A expressão da proteína STC1 full lenght foi feita em sistema de baculovírus em células de inseto, fusionada a uma cauda de 6 histidinas (STC1-HT) e após 3 passos de purificação, obteve-se a proteína em quantidade suficiente para imunização dos camundongos e em alto grau de pureza (Figura 10 B). A construção STC1 Cterminal foi expressa em sistema bacteriano (E. coli BL21 pRARE) fusionada à proteína GST (Glutathione S Transferase) e grandes quantidades da proteína foram isoladas, porém de forma 100% insolúvel a partir de corpos de inclusão, sendo necessário utilizar a técnica de refolding em solução para utilização desta proteína (Figura 10 C). Não foi possível estabelecer protocolo de expressão da construção STC1 Nterminal, nem mesmo em frações insolúveis em bactéria.
Isso fez com que a estratégia inicial fosse alterada: A imunização dos camundongos foi feita com a proteína STC1-HT e a seleção dos clones previa isolar um clone que fosse reativo a proteína full lenght e também a construção STC1 Cterminal (garantindo um clone reativo a um epítopo na região Cterminal) e isolar outro que fosse
reativo a proteína STC1-HT e não a construção STC1 Cterminal (garantido um clone reativo, teoricamente, a região Nterminal). Porém todos os 3 clones de anticorpos monoclonais isolados foram reativos à proteína STC1-HT e também à construção STC1 Cterminal.
Este resultado não garante, mas sugere que os 3 clones de anticorpos monoclonais obtidos sejam reativos ao mesmo epítopo. Porém, este dado não nos surpreendeu, visto que, como discutido na introdução, a proteína STC1 é extremamente conservada entre as diferentes espécies, principalmente pela região Nterminal (figura 4), o que sugere que a região imunogênica da proteína seja possivelmente a região Cterminal.
Figura 10. Esquema das porções N- e Cterminal de STC1 e expressão e purificação das mesmas. (A) Esquema em barra mostrando STC1 completa (STC1 full) e as construções codificando os domínios: amino- terminal sem o peptídeo sinal (NSTCǻPS) e carboxi terminal (CSTC1). São mostradas a região do peptídeo
sinal (PS, verde), as cisteínas (barras em vermelho) e suas respectivas pontes dissulfeto (linhas conectando as cisteínas) e a cisteína responsável pela dimerização de STC1 (, cisteína 202). (B) Gel SDS-PAGE mostrando o alto grau de pureza da proteína STC1-HT produzida em baculovírus. A-L são diferentes frações obtidas pela purificação em gel filtração. (C) Gel SDS-PAGE mostrando o isolamento e a pureza da proteína STC1 Cterminal-GST após processo de refolding em solução. L1 e L2 são amostras da lavagem da coluna de purificação por afinidade. A e B são frações da eluição. M ± Marcador de peso molecular.
Entretanto, visto que a forma normalmente encontrada de STC1 consiste em um homodímero que se mostra alongado em solução (Trindade DM, et al., 2009), mesmo que estes clones de anticorpos monoclonais sejam reativos ao mesmo epítopo, é possível que o anticorpo de captura se ligue em um dos monômeros, deixando disponível o outro monômero para que este seja identificado pelo anticorpo de detecção.
Os 3 clones de anticorpos monoclonais obtidos, foram biotinilados in vitro, para serem testados como anticorpos de detecção e para que não fosse preciso utilizar um terceiro anticorpo conjugado, o que poderia gerar sinais inespecíficos e artefatuais. Desta forma, a revelação do ensaio de ELISA pode ser feita utilizando-se estreptavidina fusionada a enzima HRP (horseradish peroxidase), beneficiando-se da altíssima afinidade desta molécula pela biotina, e garantindo que não haja reação cruzada com o anticorpo de captura (não biotinilado).
Baseado nesta hipótese, os 3 clones de anticorpos monoclonais foram utilizados em ensaios de ELISA sanduiche, tanto na função de captura do antígeno, quanto na função de detecção (clones biotinilados). Para isso, todas as combinações possíveis entre eles foram testadas (Tabela 3), utilizando diversas concentrações destes anticorpos, assim como diversas quantidades do antígeno (STC1-HT), para se identificar a sensibilidade do ensaio.
Tabela 3. Nove diferentes combinações testadas entre os 3 clones de anticorpos monoclonais anti- STC1 humana, para ensaio de ELISA sanduiche. Apesar da possibilidade de todos os clones serem reativos ao mesmo epítopo de STC1-HT, o fato da proteína em sua fora fisiológica ser um homodímero, possibilitou que o mesmo clone fosse testado tanto para captura, quanto para detecção do antígeno.
Anticorpos de Captura Clone 1 Clone 2 Clone 3 Anticorpos de Detecção (biotinilados) Clone 1 1x1 2x1 3x1 Clone 2 1x2 2x2 3x2 Clone 3 1x3 2x3 3x3
A combinação de anticorpos que melhor funcionou na identificação de STC1-HT em ensaio de ELISA sanduiche, foi justamente quando se utilizou o clone 1 como anticorpo de detecção, e o próprio clone 1 como anticorpo de detecção (biotinilado). Como é exemplificado no Gráfico 1, outras combinações de anticorpos não produzem sinais proporcionais e significativos, ao passo que essa combinação de anticorpos (Gráfico 2) se comportam de forma linear de acordo com as diferentes concentrações testadas para ambos.
Gráfico 1. Ensaio de ELISA para proteína STC1. Neste ensaio o anticorpo monoclonal clone 1, foi utilizado para captura do antígeno e o anticorpo monoclonal clone 2 para detecção (biotinilado).
Gráfico 2. Ensaio de ELISA para proteína STC1. Neste ensaio o anticorpo monoclonal clone 1, foi utilizado tanto para captura do antígeno, quanto para detecção (biotinilado). Isso é possível devido ao fato de STC1 ser um homodímero. Observa-se um aumento do sinal de absorbância de acordo com o aumento da quantidade de anticorpos utilizados, demonstrando que o ensaio foi positivo.
Além disso, concentrações crescentes de STC1-HT foram testadas, para avaliar a sensibilidade do ensaio. De 500 pg/mL a 500ug/mL, a menor quantidade de STC1-HT que o ensaio ELISA foi capaz de detectar de forma confiável foi 2ng/mL, como mostrado no gráfico 2. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 500 1000 1500 2000 A b s 650nm
Anticorpo de Detecção Biotinilado -‐ ng/mL ELISA -‐ Clone 1 captura Clone 2 biotina detecção Stanniocalcin-‐1 -‐ 2ng/mL 1ng/mL 2 ng/mL 3 ng/mL 4 ng/mL Anticorpo de Captura (não biotinilado) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 500 1000 1500 2000 A b s 650nm
Anticorpo de Detecção Biotinilado -‐ ng/mL
ELISA -‐ Clone 1 captura
Clone 1 biotina detecção
Stanniocalcin-‐1 -‐ 2ng/mL
1ng/mL 2 ng/mL 3ng/mL 4ng/mL Anticorpo de Captura (não biotinilado)Este resultado, ainda que preliminar, despertou interesse em uma empresa, cujo foco é justamente o desenvolvimento de kits ELISA imunodiagnósticos. Residente na Incubadora de Empresas da Unicamp (INCAMP), a RheaBiotech atua na área de biotecnologia a cerca de 4 anos e desenvolve anticorpos e ensaios ELISA para o mercado nacional.
Atualmente, o contrato de transferência de tecnologia e know how está em elaboração e deverá ser finalizado em breve. Essa parceria envolve o LNBio, o Centro Infantil Boldrini e a RheaBiotech, e o contrato, no que diz respeito a parte científica, prevê:
- Finalização conjunta do desenvolvimento do kit diagnóstico (LNBio / Rhea); - Testes iniciais em soro de camundongos com leucemia (LNBio / Boldrini / Rhea); - Testes finais em soro de pacientes leucêmicos (LNBio / Boldrini / Rhea),
- Disponibilização no mercado do kit diagnóstico (RheaBiotech).
Esse desenvolvimento em conjunto com a iniciativa privada é vital para que esta tecnologia seja absorvida de forma prática e efetiva. A idéia atual é utilizar este teste de ELISA como uma ferramenta a mais no diagnóstico da leucemia, porém, no momento oportuno, o seu potencial também será avaliado quanto a sua utilidade no prognóstico, acompanhamento do tratamento e remissão. Também está previsto que este kit possa ser testado para as mesmas finalidades em outros tipos de câncer, uma vez que a literatura sugere que STC1 também possa ser usada como biomarcador de outros tipos de câncer.
3.2 - Identificar parceiros de interação para STC1 humana, dentro e fora da célula, visando compreender melhor as vias de atuação e possíveis funções.
Diferentes estratégias foram utilizadas buscando-se identificar parceiros de interação para proteína humana STC1, uma vez que nenhum trabalho havia relatado interações moleculares para esta proteína. A identificação de proteínas que estabeleçam interação com STC1 é relevante para que se possa propor e identificar vias de atuação, rotas moleculares e processos celulares que permitam um melhor entendimento da forma de ação desta proteína dentro e fora da célula humana e auxilie no estabelecimento de funções específicas.
3.2.1 ± O ensaio de duplo híbrido em leveduras
A primeira abordagem feita pelo nosso grupo, visando identificar parceiros de interação para STC1 humana, foi através do sistema de duplo-híbrido em leveduras. Para realizar este screening a proteína STC1 foi clonada em vetor pBTM116 fusionado ao domínio de ligação ao DNA, LexA. Nesta clonagem, a extremidade amino-terminal foi deletada, de forma a excluir a região correspondente ao peptídeo sinal (LexA- 67&ǻ63D evitando assim a secreção desta proteína e garantindo sua permanência intracelular.
Antes de se realizar o screening, a construção LexA-67&ǻ63D IRL WHVWDGD SRU ensaio de ativação autônoma para os genes repórteres (His3 e LacZ) e não observamos nenhuma auto-ativação dos repórteres. Isso demonstra que STC1 por si só, não tem a capacidade de ativar os genes repórteres e de gerar falsos positivos. As interações identificadas demonstram, portanto, uma interação específica e direta com a proteína STC1. A ausência de auto-ativação da isca é um pré-requisito absoluto para o sucesso da execução de um screening através do sistema de duplo-híbrido em leveduras.
Tendo este controle assegurado, nós realizamos este screening em bibliotecas humanas de cDNAs de cérebro fetal, medula óssea e leucócitos. A construção usada como isca, LexA-67&ǻ63D JHURX FHUFD GH [ 6 clones co-transformados,
considerando as três bibliotecas usadas e todos foram testados contra os dois genes repórteres.
Um mapa de interações foi desenhado para STC1 e tais interações exibem uma complexa rede (Figura 11). Um total de 22 proteínas foram identificadas e seus fragmentos e domínios assim como suas localizações celulares de acordo com o GeneOnthology (Lomax J, 2005) são apresentadas na tabela 4.
As proteínas foram agrupadas, de acordo com seus respectivos compartimentos celulares, em sete grupos, apesar de algumas proteínas estarem presentes em mais um grupo: nucleares (LMNA, MAPK14, FUS, QRICH1, SAP18, SP100 e SUMO1), retículo endoplasmático (ERN1, JSRP1, TMEM132a, e FLJ20254), mitocôndria (MTND1 e ALAS2), citoplasma, (ALDOA, FTL, MAPK14 e SUMO1), membrana plasmática (ANPEP, CMTM3, DAGLB, FNDC4 e TMEM132a), extracelular/secretada (ELA2) e células vermelhas do sangue (HBA1/2). Apesar de QRICH1 e FLJ20254 não terem informações sobre suas localizações celulares no GeneOnthology, nós utilizamos o programa preditor PSORT II (Nakai K, et al., 1999) para inferir sua possível localização, sendo assim possível agrupá-las.
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Figura 11. Mapa de interações da proteína humana STC1. Este diagrama mostra de forma simplificada a rede de interações de proteínas encontradas pelo screening com sistema de duplo-híbrido em levedura (ZBTB16 foi omitido neste diagrama, uma vez que pode se tratar de um falso positivo). As linhas indicam interações e cada cor é um indicativo do dado publicado sobre cada interação (as novas interações encontradas neste trabalho, são indicadas pelas linhas amarelas, ligado STC1 a suas presas). Cada proteína é representada por diferentes código de cores gerado pelo programa Osprey (Breitkreutz BJ, et al., 2003) de acordo com a classificação do GeneOnthology (Santos MT, et al., 2011).
Tabela 4. Proteínas identificadas no ensaio de duplo híbrido em leveduras (Santos MT, et al., 2011)
Para confirmar as interações identificadas pelo sistema de duplo híbrido, nós realizamos um ensaio de GST-pull down cruzando as proteínas identificadas no screening (fusionadas a uma cauda de GST), com a proteína STC1-HT produzida em células de insetos. Ao analisarmos os 22 clones, 18 cDNAs tinham o frame da sequência compatível com a estratégia de clonagem, para transferência direta do vetor pACT2 para os vetores de expressão com cauda GST. Destes 18, fomos capazes de sub-clonar 11 e, destes, apenas sete (apresentados na figura 12 ± SP100, FUS, JSRP1, SUMO1, TMEM132a, FDNC4-FIII e LMNA) apresentaram expressão de proteínas solúveis. No caso da proteína
FNDC4, foram desenhados primers para amplificar apenas a região extracelular (que é composta principalmente por um domínio de fibronectina tipo III [FNIII]). Mesmo utilizando PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) como inibidor de proteases, algumas das proteínas expressas fusionadas a GST apresentaram alguma degradação nas condições de expressão que fomos capazes de estabelecer para obter expressão solúvel destas proteínas.
A proteína STC1-HT recombinante foi capaz de se ligar a todas as sete proteínas testadas (fusionadas a GST), mas não a proteína GST sozinha, demonstrando a especificidade das interações observadas (Figura 12).
Figura 12. Confirmação in vitro das interações de STC1 com proteínas identificadas no sistema de duplo híbrido em leveduras. O ensaio de GST-pull down entre STC1-HT produzida em sistema de baculovírus e fragmentos das proteínas selecionadas. Todas as presas são proteínas fusionadas a GST. Os asteriscos indicam o peso molecular teorico destas proteínas recombinantes fusionadas a GST. A cabeça de seta indica o GST livre. INPUT indica a adição de GST no western blot superior (WB: anti-GST) e de STC1-HT no western blot inferior (WB: anti-6xHis) como controle positivo. (Santos MT, et al., 2011)
Baseado no fato de que a região N-terminal da proteína STC1 é extremamente conservada entre todas as espécies e também com STC2, aliado aos dados estruturais de SAXS do nosso grupo (Trindade DM, et al., 2009 ± Figura 4), que sugerem que o homodímero de STC1 seja feito de forma anti-paralela, expondo as regiões Nterminal mais globulares nas extremidades, acredita-se que esta seja a região responsável por executar as atividades funcionais de STC1. A região Cterminal, teria um papel mais de coordenação estrutural, responsável pela homodimerização.
Para investigar esta hipótese, nós geramos duas construções de STC1 fusionadas ao domínio de ligação ao DNA, LexA, dividindo STC1 em aproximadamente duas metades (uma amino-terminal e uma carboxi-terminal, nomeadas LexA-1 67&ǻ63E H LexA-C STC1, respectivamente). O corte entre estas duas metades foi feito de forma arbitrária, porém em uma região central onde não existe a conexão de nenhuma ponte dissulfeto na sequência primária da proteína (Figura 13 A). Ambas as construções foram testadas contra as presas identificadas no sistema e duplo híbrido.
Praticamente todas as proteínas testadas foram capazes de interagir com a região Nterminal de STC1 mas não com a região Cterminal. Interessantemente, FNDC4 foi capaz de estabelecer interação com ambas as regiões de STC1 (Figura 13 B).
Durante o mapeamento da interação entre ZBTB16 e as construções de STC1 N- e Cterminal, essa presa sozinha apresentou XPD DWLYLGDGH ȕ-galactosidase inespecífica (auto-ativação) com o vetor pBTM116 vazio (LexA apenas). O ensaio de confirmação com todas as presas sozinhas é essencial para que se exclua a possibilidade de que estas tenham características que ative a transcrição dos genes repórteres, gerando assim falsos positivos. No caso do regulador transcripcional ZBTB16, a auto-ativação dos genes repórteres já era esperada (Kelly KF, et al., 2006; Raberger J, et al., 2008). Desta forma, ZBTB16 foi considerado um falso positivo e descartado da análise.
Este resultado confirmou que a região de STC1 responsável por interagir com seus parceiros, é de fato a porção Nterminal e que provavelmente é a região da proteína responsável por realizar suas funções. Por tratar-se de um homodimero anti-paralelo que, ao que parece, expõe as regiões Nterminais, provavelmente STC1 possa interagir com mais de um parceiro ao mesmo tempo.
Figura 13. Mapeamento da região de interação de STC1 com suas presas através de sistema duplo híbrido em levedura. (A) Representação esquemática da proteína humana STC1 inteira e diferentes contruções com o dominio de ligação ao DNA, LexA. A representação linear da sequência de aminoácidos de STC1é mostrada com a indicação de diferentes porções (peptideo sinal [SP] em branco, pró-peptideo [PP] em cinza escuro e a cadeia madura da proteína em preto), suas pontes dissulfeto (brackets) e região responsável pela dimerização (Dimer). Todas construções produziram proteínas fusionadas com LexA na região Nterminal. LexA-STC1ǻ63DIRLXVDGDLQLFLDOPHQWHFRPRLVFDQRVLVWHPDGH duplo híbrido, e todas as três construções usadas para mapear a região de interação de STC1. A barra em cinza claro indica a região do linker derivada da clonagem. (B) )HQyWLSRGDVFRO{QLDVVXEPHWLGDVDRWHVWHGHȕ-galactosidase em leveduras da cepa L40 co-transformadas com construções do vetor pBTM116 expressando as iscas fusionadas ao LexA (indicadas no lado direito) e com presas fusionadas ao domínio de ativação Gal4 (indicado acima). (Santos MT, et