Resultados e Discussão - Open Planejamento e otimização de um método para determinação de vit

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3 – Resultados e Discussão

Conforme descrito na secção 2.2.1, o SQLFB depende dos componentes válvulas solenóides e bomba peristáltica para conduzir e direcionar fluídos de um ponto a outro do sistema.

Para atender os requisitos que qualificam uma análise química, esses componentes devem garantir uma grande precisão na inserção dos volumes de amostras e reagentes na câmara QLFB.

Diante do exposto, definiu-se um estudo dos volumes inseridos por cada válvula solenóide utilizada no SQLFB em diferentes velocidades da bomba peristáltica.

3.1 _{– Do Estudo dos Volumes e Vazões do SQLFB}

Todos os volumes mencionados nos procedimentos de análise foram estabelecidos mediante estudo das vazões e tempos de acionamento das válvulas solenóides.

O estudo consistiu em determinar a vazão em cada linha de fluxo para depois definir os tempos de acionamento.

A vazão em cada linha de fluxo foi determinada pelos volumes de água coletados e medidos em massa numa balança analítica segundo os tempos de abertura de válvula de 1 e 3 segundos.

Para cada canal foram realizadas medidas empregando quatro diferentes velocidades de rotação da bomba peristáltica: 20, 30, 40 e 46 rpm.

Para realizar as medidas foram utilizados: uma balança analítica SCIENTECH modelo SA210 (0,1mg); a bomba Gilson MiniPuls 3 e tubos de tygon de 2,06mm; um microcomputador; o acionador de válvulas e seis válvulas solenóides three-way (V1, V2,

V3, V4, V5 e V6 que são as mesmas mencionadas nas seções 2.3.1, 2.4.3, 2.5.1).

A partir do resultado do estudo, buscou-se eleger não só as válvulas mais precisas, mas também as que permitiam maior vazão para que assim pudessem ser baixados os tempos de acionamento o que equivale a redução do tempo total de análise.

A seguir, são apresentados nas Tabelas 06, 07, 08 e 09 os dados com vazões e os desvios padrão estimados para os tempos de abertura de válvula (1 e 3s) e nas quatro diferentes velocidades de rotação da bomba peristáltica: 20, 30, 40 e 46 rpm.

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Tabela 06 – Dados de vazão e DPR das válvulas solenóides V1 a V6 na velocidade de rotação da

bomba peristáltica de 46 rpm.

46 rpm Vazão (L.s-1) Desvio Padrão Relativo (%)

Válvula t = 3s t = 1s t = 3s t = 1s V1 0,0426 0,0253 1,6649 14,8622 V2 0,2037 0,2032 0,4840 4,5888 V3 0,2340 0,2306 1,1536 0,7754 V4 0,2321 0,2296 0,3015 0,9395 V5 0,2032 0,1589 0,7321 5,2038 V6 0,3476 - 1,1438 -

Tabela 07 – Dados de vazão e DPR das válvulas solenóides V1 a V6 na velocidade de rotação da

bomba peristáltica de 40 rpm.

40 rpm Vazão (L.s-1₎ _{Desvio Padrão Relativo (%)}

Válvula t = 3s t = 1s t = 3s t = 1s V1 0,0378 0,0208 1,2712 18,1477 V2 0,1827 0,1795 0,7007 3,0601 V3 0,2018 0,1991 0,5457 0,7369 V4 0,2010 0,1994 0,3043 2,1198 V5 0,1787 0,1372 1,0522 7,4794 V6 0,3075 - 0,9045 -

Tabela 08 – Dados de vazão e DPR das válvulas solenóides V1 a V6 na velocidade de rotação da

bomba peristáltica de 30rpm.

30 rpm Vazão (L.s-1) Desvio Padrão Relativo (%)

Válvula t = 3s t = 1s t = 3s t = 1s V1 0,0297 0,0140 1,3944 15,2787 V2 0,1406 0,1384 1,6256 6,9133 V3 0,1508 0,1489 0,7681 9,2154 V4 0,1509 0,1464 2,3052 11,1360 V5 0,1317 0,0986 0,8739 3,5710 V6 0,2345 - 1,9447 -

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Tabela 09 – Dados de vazão e DPR das válvulas solenóides V1 a V6 na velocidade de rotação da bomba

peristáltica de 20rpm.

20 rpm Vazão (L.s-1) Desvio Padrão Relativo (%)

Válvula t = 3s t = 1s t = 3s t = 1s V1 0,0242 0,0079 2,5700 15,2907 V2 0,0952 0,0918 3,9657 1,4727 V3 0,0992 0,0986 1,2533 1,7316 V4 0,1021 0,0999 2,4919 13,5721 V5 0,0848 0,0719 1,8533 9,6243 V6 0,1621 - 0,6410 -

Observando os resultados do estudo de vazões, constatou-se que 46 e 40 rpm são as velocidades rotacionais da bomba peristáltica, em que as válvulas apresentaram o menor desvio padrão relativo (DPR). Salvo o bom resultado encontrado quando se trabalha com 40rpm (3s de acionamento - 0,79% e 1s de acionamento - 6,31%), é com 46rpm que se pode diminuir o tempo de análise garantindo ainda um DPR baixo (3s de acionamento - 0,91% e 1s de acionamento - 5,27%). Com base nesse fato, foi adotado 46 rpm como velocidade rotacional da bomba peristáltica durante o ingresso dos volumes de reagentes e amostras na câmara QLFB. Na etapa de limpeza da câmara, a bomba peristáltica foi acelerada para 48 rpm (rotação máxima da bomba) e utilizadas as válvulas V2 e V6, uma vez que nessa etapa não exige grande precisão.

3.2 – Do Planejamento Fatorial da Quimiluminescência do Luminol-Cobalto(II)

Conforme apresentado na secção 2.3 além das variáveis definidas no planejamento fatorial, existem outras que podem influenciar no rendimento da reação quimiluminescente, tais como: temperatura do meio; teor de oxigênio dissolvido; e estabilidade dos reagentes e amostras.

Para que essas variáveis não se tornassem relevantes sobre os experimentos, foram tomadas algumas precauções. No caso da temperatura ambiente, fez-se um monitoramento da temperatura do laboratório que ficou controlada em 26,5±0,5ºC, e assim ocasionando estabilidade térmica dos reagentes e amostras que estavam sendo utilizadas no momento das análises. Como o laboratório dispunha de aparelhos de ar- condicionado equipados com sistemas de aquecimento, bastou apenas que os mesmos ficassem ajustados à temperatura de 27ºC.

- 61 - Os experimentos foram realizados num intervalo de quatro horas sofrendo variação de 26°C a 27°C. Portanto, considerou que os experimentos não foram significativamente afetados pela temperatura do meio e, assim, sem possibilidade de que essa variável se tornasse um fator para o planejamento.

Quanto ao oxigênio dissolvido no meio, foi utilizada água deionizada na preparação de todos os reagentes e amostras. Tendo em vista que para tal qualidade de água o teor de oxigênio dissolvido é baixo e constante, concluiu-se que a influência dessa variável sobre os resultados dos experimentos seria desprezível e por tanto desconsiderada do planejamento também.

Para manter a boa estabilidade dos reagentes e garantir a menor influência desta sobre o sinal luminescente, utilizaram-se soluções de luminol com um dia pós- preparação e soluções de peróxido de hidrogênio com duas horas pós-preparação mantidas antes sob refrigeração a 10ºC, conforme recomendações encontradas na literatura[18,19,54].

Passado essa etapa de tratamento preventivo de variáveis, seguiu-se para a execução dos ensaios do planejamento proposto.

O sistema de detecção exigiu, sempre antes de realizar as medidas, um intervalo de estabilização para manter constante o sinal da linha base (background). Esse tempo foi investigado de acordo com as necessidades das análises e estabelecido entre vinte e trinta minutos. Lembrando que todas às vezes o sinal da linha de base estabilizado de um dia era comparado com o do dia anterior afim de que realmente não estivesse sofrendo alteração de seu patamar.

Foram experimentadas 16 combinações diferentes dos quatro fatores pré- selecionados com base no estudo bibliográfico realizado sobre a quimiluminescência do luminol-cobalto(II) e descrito na seção 2.3.

No planejamento fatorial proposto buscou-se a influência direta de cada combinação sobre o sinal quimiluminescente de uma amostra padrão de 3,0 g L-1_de

CoCl2. Assim a intensidade do sinal QL deste padrão foi adotada como sendo a

resposta do planejamento proposto.

O SQLFB garantiu precisão necessária para realizar 16 experimentos de forma aleatória em quintuplicatas. Os resultados estão apresentados na Tabela 10.

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Tabela 10 – Resultados do planejamento fatorial 24_{da quimiluminescência do luminol e cobalto(II). Onde} M é a média dos valores das replicatas, S é o desvio padrão absoluto, Rn IQLR da enésima replicata , L é

a concentração de luminol, P é a concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2), H é a concentração de

hidróxido de sódio (NaOH) e O, a ordem de mistura.

Ensaio Ordem P H L O R1 R2 R3 R4 R5 M S 1 4º - - - - 38,90 33,85 49,21 33,95 54,67 42,13 9,39 2 15º + - - - 108,16 126,41 115,13 120,26 131,56 120,30 9,20 3 9º - + - - 68,50 64,10 66,67 71,00 75,45 69,14 4,34 4 5º + + - - 256,41 242,75 247,00 266,15 255,43 253,55 9,08 5 13º - - + - 84,21 151,84 107,44 141,80 145,78 126,21 29,15 6 1º + - + - 177,96 247,18 245,81 131,45 231,12 206,70 50,63 7 10º - + + - 144,10 148,97 131,03 126,58 132,31 136,60 9,48 8 3º + + + - 644,75 649,00 628,00 634,10 621,28 635,43 11,49 9 14º - - - + 391,32 396,32 392,37 429,74 405,26 403,00 15,92 10 11º + - - + 215,79 210,79 197,37 215,13 211,05 210,03 7,43 11 2º - + - + 161,80 168,72 187,18 165,90 176,15 171,95 10,00 12 12º + + - + 216,41 224,10 219,74 217,44 222,75 220,09 3,31 13 6º - - + + 1379,74 1371,79 1456,41 1511,11 1450,53 1433,92 58,17 14 16º + - + + 1909,23 1882,50 1882,31 1812,25 1880,00 1873,26 36,16 15 8º - + + + 1176,05 1004,87 1036,15 933,50 1170,26 1064,18 106,21 16 7º + + + + 1318,25 1258,16 1351,60 1250,30 1319,19 1299,50 43,54

Observando com atenção a média M em cada ensaio, percebe-se que existe grande variação de valores, de até cerca de 40 vezes a diferença entre o menor e o maior valor. De fato, isso comprova ―a priori”, a influência da variação de níveis entre os fatores experimentados. Porém observa-se para as replicatas de cada ensaio um desvio padrão elevado o que a princípio colocaria em ―cheque‖ a precisão do SQLFB, porém a verdadeira fonte de tamanha variância entre as replicatas se justifica pelas diferenças químicas e físicas existentes em cada combinação de fatores e seus níveis aliada à variância das medidas de IQLR. Pois como se trata de combinações muito distintas da esperada conforme a literatura, algumas dessas produzem reações com rotas que levam à formação de gases como também de colóides que influenciam diretamente na recepção da quimiluminescência gerada por elas por causarem desvios na trajetória da radiação em direção ao detector.

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3.2.1 – O Modelo Estatístico

Os dados da Tabela 10 foram tratados em planilha eletrônica ExcelMicrosoft para criar gráficos e estimar os efeitos principais e de interação presentes na Tabela 11.

Tabela 11 – Efeitos calculados para planejamento fatorial 24_{da Tabela 10 e seus erros padrão (%). Onde} M é a média geral dos efeitos do planejamento, L é a concentração de luminol, P é a concentração de

peróxido de hidrogênio (H2O2), H é a concentração de hidróxido de sódio (NaOH) e O, ordem de mistura.

Valor Erro Padrão (%) Intervalo de Confiança _{(n=16 e 95%)}

Média 516,62 ± 4,16 > 516,62 - 8,83 e < 516,6 + 8,83

a)

Efeitos principais

P 171,47 ± 8,33 > 171,47 - 17,66 e < 171,47 + 17,66 H -70,64 ± 8,33 > -70,64 - 17,66 e < -70,64 + 17,66 L 660,70 ± 8,33 > 660,70 - 17,66 e < 660,70 + 17,66 O 635,73 ± 8,33 > 635,73 - 17,66 e < 635,73 + 17,66

b)

Efeitos das interações de dois fatores

PH 70,21 ± 8,33 > 70,21 - 17,66 e < 70,21 + 17,66 PL 142,03 ± 8,33 > 142,03 - 17,66 e < 142,03 + 17,66 PO -39,01 ± 8,33 > -39,01 - 17,66 e < -39,01 + 17,66 HL -55,46 ± 8,33 > -55,46 - 17,66 e < -55,46 + 17,66 HO -220,48 ± 8,33 > -220,48 - 17,66 e < -220,48 + 17,66 LO 505,75 ± 8,33 > 505,75 - 17,66 e < 505,75 + 17,66

c)

Efeitos das interações de três fatores

PHL -16,63 ± 8,33 > -16,63 - 17,66 e < -16,63 + 17,66

PHO -60,94 ± 8,33 > -60,94 - 17,66 e < -60,94 + 17,66

PLO 62,84 ± 8,33 > 62,84 - 17,66 e < 62,84 + 17,66

LHO -125,17 ± 8,33 > -125,17 - 17,66 e < -125,17 + 17,66

d)

Efeitos das interações de quatro fatores

- 64 - O erro padrão dos efeitos foi estimado em 8,33% e a metade deste como erro padrão da média global, em 4,16%. Os valores dos efeitos de cada fator e de suas interações foram apresentados na Tabela 11 junto aos seus erros padrão e intervalos de confiança com base na distribuição T de Student.

Utilizando análise dos intervalos de confiança a partir das replicatas – AICR (seção 1.3.1.2) estimou-se, com o erro padrão de 8,33%, um intervalo de confiança (n=16, 95% de confiança e t = 2,12) de:

(11)

Analisando rapidamente os resultados apresentados na Tabela 10 segundo o intervalo de confiança supracitado, conclui-se que todos os efeitos são significativamente diferentes de zero, exceto o efeito de interação PHL e que, portanto o mesmo não merece interpretação. Todos os outros efeitos têm representativa importância para a reação do luminol-cobalto(II) com destaque para os efeitos principais e de interação de segunda ordem que envolve os fatores: concentração de luminol (L) e ordem de mistura (O). Com base nessa afirmativa, o modelo estatístico levantado para o planejamento proposto será:

(12) onde X1, X2, X3, X4 são os valores unitários dos coeficientes de contraste da Tabela 05,

segundo cada ensaio.

Os resíduos médios gerados nesse modelo estão apresentados na Figura 3.1.

Figura 3.1 – Gráfico dos resíduos de cada ensaio experimental deixados pelo modelo da Equação 12.

66 ,

17

66 ,

17 





 

E

Y = 516,62 + 85,73X

- 35,32X

+ 330,53X

+ 317,8 X

+

35,10X

₁

X

₂

+ 71,01 X

₁

X

₃

- 19,50X

₁

X

₄

- 27,73X

₂

X

₃

-

110,24X

X

+ 252,87X

X

- 30,47X

X

+ 31,42X

X

- 62,58 X

X

- 47,33 X

X

± 8,33

- 65 - Nota-se na Figura 3.1 que os resíduos seguem um padrão linear constante, que se distribuem aleatoriamente sobre a média zero e com pouca variação. Isso é uma forte evidência de que o modelo está bem ajustado aos resultados da Tabela 10.

Os resultados do planejamento também foram analisados por outros dois métodos de análise de significância, o método do cálculo do erro padrão pelo efeito de maior ordem - MEMO e o método do gráfico normal - MGN (seção 1.3.1.2). Para o MEMO, o erro padrão foi estimado a partir dos efeitos de terceira e quarta ordem em 80,70% que ao nível de confiança de 95% (n=5) e valor de t é igual 2,571, resulta num intervalo de confiança de:

(13) Conclusão, segundo esse intervalo de confiança do MEMO, diferentemente do AICR, pode-se afirmar que dentre todos os efeitos apenas os principais L, P, O e de interação LO e HO representam algum significado estatístico. Com base nessa afirmativa, ter-se-á que o modelo que melhor representa o sistema químico luminol- cobalto(II) estudado é:

Y = 516,62 + 330,53 X3 + 317,84 - 110,24 X2 X4 + 252,87 X3 X4 ± 80,70 (14)

Conforme visto na Figura 3.2, os resíduos médios gerados pelo modelo da equação 14 se distribuem de forma distinta aos gerados pelo modelo da equação 12.

Figura 3.2 _{– Gráfico dos resíduos de cada ensaio experimental deixados pelo modelo da Equação 14.}

Os resíduos desse modelo parecem também seguir um padrão linear constante e com uma distribuição aleatória sobre a média zero, porém seus valores são maiores que os apresentados pelo modelo anterior, comprovando que estão menos ajustados aos dados da Tabela 10.

Numa outra análise, dessa vez utilizando o método do gráfico normal - MGN (seção 1.3.1.2) a conclusão é idêntica a encontrada pelo AICR.

49 ,

207

49 ,

207 





 

E

- 66 - Pelo MGN, o gráfico da Figura 3.3 explicita que apenas o efeito PHL confunde- se com o ―ruído‖ e, portanto apenas ele é sem importância para o estudo proposto. Essa é a mesma conclusão apresentada pelo método AICR, que também comprova que três dos quatro efeitos principais tem efeitos positivos sobre o sinal quimiluminescente do luminol-cobalto(II), aliado a outros quatro de interação de segunda ordem e um de terceira ordem. Portanto o modelo MGN é idêntico ao da Equação 12.

Figura 3.3 – Gráfico normal dos efeitos estimados no planejamento fatorial 24_{luminol-cobalto(II). L}

representa a concentração de luminol, P representa a concentração de peróxido de hidrogênio, H representa a concentração de hidróxido de sódio e O representa a ordem de mistura.

- 67 - Por fim, dentre os três métodos utilizados (AICR, MEMO e MGN) para definir o grau de significância dos efeitos e, portanto, dos parâmetros e suas interações, apenas o MEMO assume um modelo em que dez efeitos (H, PL, HL, PH, PO, PHL, PLO, HLO,

PHO e PHLO), não têm significado físico, enquanto que o AICR e o MGN assumem um

mesmo modelo que confirma um único efeito não significativo (PHL). Tem-se, portanto dois modelos distintos.

Para avaliar numericamente a qualidade de ajuste dos dois modelos levantados pelos métodos de análises de significância, foi utilizada a ANOVA completa tomando como critérios: as menores médias quadráticas e também as menores falta de ajuste do modelo aos dados do planejamento realizado.

A seguir são apresentadas as tabelas de análises de variância.

Tabela 12 – Análise de variância ou ANOVA para ajuste do modelo cúbico da Equação 12 utilizando o método dos mínimos quadrados. Onde g.l. significa grau de liberdade, MQR/MQr é a relação entre a média quadrática da regressão (MQR) com a dos resíduos (MQr), MQfaj/MQep é a relação entre a média quadrática da falta de ajuste do modelo (MQfaj) com a do erro puro (MQep), F14,65 é o valor da constante

F na distribuição F com 14 graus de liberdade (cálculo da regressão) e com 65 graus de liberdade (cálculo dos resíduos) e F1,64 o valor de F para 1 grau de liberdade (cálculo da falta de ajuste) e 64 graus

de liberdade (cálculo do erro puro). Modelo da Equação 12

Fonte de Variação Soma Quadrática Nº de g.l. Média Quadrática

Regressão 24829032,46 14,00 1773502,32 Resíduos 94318,64 65,00 1451,06 Falta de ajuste 5530,76 1,00 5530,76 Erro puro 88787,88 64,00 1387,31 Total 24923351,10 79,00  % de variação explicada (R2₎ _99,62 _ _

% máxima de variação explicada 99,64  

MQR/MQr F14,65 = 1,87 a 95% 10xF14,65 << 1222,21

- 68 -

Tabela 13 – Análise de variância ou ANOVA para ajuste do modelo cúbico da Equação 14 utilizando o método dos mínimos quadrados.Onde g.l. significa grau de liberdade, MQR/MQr é a relação entre a média quadrática da regressão (MQR) com a dos resíduos (MQr), MQfaj/MQep é a relação entre a média quadrática da falta de ajuste do modelo (MQfaj) com a do erro puro (MQep), F14,65 é o valor da constante

de liberdade (cálculo do erro puro). . Modelo da Equação 14

Fonte de Variação Soma Quadrática Nº de g.l. Média Quadrática

Regressão 22901470,99 4,00 5725367,75 Resíduos 2021880,10 75,00 26958,40 Falta de ajuste 1933092,22 11,00 175735,66 Erro puro 88787,88 64,00 1387,31 Total 24923351,10 79,00  % de variação explicada (R2₎ _91,89 _ _

% máxima de variação explicada 99,64  

MQR/MQr F4,75 = 2,51 a 95% 10xF4,75 > 212,39

MQfaj/MQep F11,64 = 1,95 a 95% F11,64 < < 126,67

Analisando as duas tabelas, percebe-se que o modelo da Equação 12 é superior ao da Equação 14:

a) Primeiro ponto: a média quadrática de regressão da Equação 12 é mais de três vezes menor que a da Equação 14 o que sinaliza maior ajuste deste primeiro modelo à média populacional.

b) Segundo ponto: as médias quadráticas do resíduo e da falta de ajuste da

Equação 12 que são, respectivamente, dezoito e trinta e uma vezes

menores que os da Equação 14.

c) Terceiro ponto: as duas análises de variância mostram claramente o quanto o modelo da Equação 12 se aproxima da máxima variação explicada com 95% de confiança, o quanto esse modelo possui uma regressão altamente significativa.

- 69 - d) Quarto e último ponto: a falta de ajuste do modelo da Equação 14 torna-se

ainda mais evidente com o teste F, onde MQfaj/MQep é quase sessenta e

cinco vezes maior que F11,64 enquanto que o modelo da Equação 12 não

possui falta de ajuste.

Ficou comprovado, pela ANOVA, que o modelo da Equação 12 é o que melhor representa os dados da Tabela 10 e por sua vez comprova que todos os efeitos calculados no planejamento experimental proposto são significativos exceto o efeito

PHL. Analisando a Figura 3.3 percebe-se, de fato, que os efeitos PL e H têm valores

opostos e praticamente equivalentes. Cabe então salientar que essa comprovação só foi possível porque as medidas de intensidade dos sinais quimiluminescentes foram realizadas em replicatas autênticas e pelo SQLFB, pois caso contrário, não haveria outra forma de estimar o erro padrão e o intervalo de confiança senão pelo MEMO, o que induziria como visto antes, a desconsiderar o efeito principal da concentração de hidróxido de sódio (H), quatro efeitos de interação de segunda ordem e o de quarta ordem. Então a realização das replicatas garantiu que o desempenho do SQLFB e as análises previstas para as amostras sintéticas e reais de vitamina B12 não fossem

prejudicadas ou erroneamente conduzidas. Além disso, a precisão do SQLFB alcançada na medição das replicatas permitiu uma melhor definição nos valores dos efeitos evitando confundimentos com eles mesmos e com o ponto ―zero‖.

3.2.2 – Interpretação dos Efeitos

Ficou definido que o modelo da Equação 12 foi o que melhor representou a variância total dos dados da Tabela 10. Nessa equação podem-se distinguir os valores dos efeitos principais dos efeitos de interação e até perceber que alguns deles quase chegam a se confundir entre si. Por isso uma análise dos efeitos utilizando o gráfico normal é mais que pertinente para eleger dentre todos os mais relevantes

O 1º EFEITO – No gráfico normal da Figura 3.4 é fácil notar que dois efeitos principais se destacam dos demais, são eles: o efeito da concentração de luminol (L) e o efeito da ordem de mistura (O). Sem dúvida, seria de se esperar que o efeito de aumento na concentração de luminol de 1,0x10-4 (nível -) para 1,0x10-3 mol L-1 (nível +) levaria ao aumento no sinal quimiluminescente da amostra sintética de 3,0g L-1_de

cobalto(II) utilizada nos ensaios. Independente da rota mecanística, esse efeito aumenta a concentração do 3-aminodiazoquinina que sob ação de um oxidante aumenta a formação do 3-amino-ftalato e por fim da quimiluminescência.

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Figura 3.4 _{– Interpretação do gráfico normal dos efeitos estimados no planejamento fatorial 2}4 luminol- cobalto(II). L representa a concentração de luminol, P representa a concentração de peróxido de hidrogênio, H representa a concentração de hidróxido de sódio e O representa a ordem de mistura. Marcação vermelha representa efeito antagônico e marca azul representa efeito sinérgico à reação QL.

O 2º EFEITO – A ordem de mistura revelou-se uma surpresa diante dos demais efeitos. O efeito O mostra que trabalhar com uma ordem de mistura na qual o luminol ingressa por último, Co/H2O2/NaOH/Lu (nível +), na câmara QLFB tem tanto ganho de

sensibilidade quanto trabalhar com o nível superior da concentração de luminol.

Ao ser o último componente adicionado, o luminol desprotonado na forma de 3- aminodiazoquinona, recebe a ação imediata do oxidante formado na reação anterior entre o peróxido e o cobalto(II).

- 71 - Esse mecanismo é corroborado tanto pela primeira hipótese de mecanismos proposta por Xiao e colaboradores[39], quanto por Ferreira e colaboradores[40] quando defendem a formação do superperóxido (O•2), cuja reação com o luminol desprotonado,

por estar em meio alcalino, produz diretamente o intermediário quimiluminescente excitado.

Porém quando o luminol é adicionado antes do peróxido de hidrogênio e do hidróxido de sódio Co/Lu/H2O2/NaOH (nível -), o mesmo reage antecipadamente com o

íon cobalto(II) formando muito pouca 3-aminodiazoquinona diminuindo o sinal QL. De fato as teorias mecanísticas mostram que quando não respeitada a ordem de formação dos intermediários da reação, as rotas sofrem desvios e a reação se processa com menor emissão de luz.

O 3º EFEITO – O terceiro efeito mais significativo é justamente o efeito da interação entre os dois efeitos principais mais significativos. O efeito de interação LO explicita a sinergia dos efeitos L e O comprovando que o sinal quimiluminescente ascende quando se trabalha com 1,0x10-3 _{mol L}-1_{de luminol e este ingressa como}

último componente na câmara QLFB.

O 4º EFEITO – Analisando o efeito P, mais uma vez verifica-se que o aumento da concentração favorece a reação intensificando o sinal quimiluminescente. Isto é facilmente compreensível, uma vez que sendo o peróxido de hidrogênio o responsável pela oxidação, aumentar sua concentração significaria aumentar a formação do intermediário quimiluminescente. Porém, segundo Merényi[37,38], o peróxido é apenas mais um dos prováveis oxidantes ou receptores de elétrons existentes na reação do luminol - cobalto(II). Portanto o efeito P é um efeito coadjuvante frente aos efeitos L que é o agente limitante e O, agente determinante para a rota macanística mais eficiente.

O 5º EFEITO – O efeito H é o menor dentre os efeitos principais e vai de encontro ao entendimento que quanto mais concentrado melhor, pois se apresenta como um efeito antagônico ao rendimento da reação QL.

Neste caso, trabalhar com concentração de 5,0 x10-2 mol L-1 de NaOH (nível +) implica numa desprotonação exagerada que atinge não só as aminas secundárias, mas também a única amina primária do luminol que na presença do peróxido de hidrogênio transforma-se inevitavelmente em hidroxilamina secundária desviando a rota de formação da -hidroxi-hidroperóxido, consequentemente do 3-amino-ftalato excitado e por fim a atenuação do sinal quimiluminescente. Isso faz sentido quando se observa em todas as interações de segundo e terceiro graus que H faz com os demais fatores.

- 72 - Em ordem crescente de atenuação do sinal quimiluminescente, os valores dos efeitos PH, HL, PHO, PHLO, HLO e HO comprovam respectivamente a veracidade do desvio de rota sugerida, quando se aumenta a concentração de peróxido de hidrogênio (em PH), quando aumenta a concentração de luminol (em HL), quando além do aumento de peróxido de hidrogênio se tem a ordem de mistura que favorece o ataque

No documento Open Planejamento e otimização de um método para determinação de vitamina B12 usando um sistema fluxobatelada (páginas 76-105)