4. Extração de proteínas da C. cardunculus
Para promover a extração de proteínas rompeu-se as paredes celulares da planta por congelamento e descongelamento lento e posterior homogeneização do extrato de flores.
4.1.
Precipitação de proteínas com acetona e etanol
Os coalhos líquidos obtidos pela precipitação, com acetona e etanol, dos extratos de flores de C. cardunculus são apresentados nas figuras 3 e 4, respectivamente. Foram testadas várias razões de extrato enzimático bruto:acetona/etanol, (1:1, 1:2, 1:4 e 1:6), de modo a apurar qual seria a técnica mais eficiente para concentração e purificação das enzimas presentes, investigando assim a ação de solventes orgânicos (acetona e etanol) que são compostos comummente usados para esta finalidade.
Após a adição do solvente o sistema foi mantido em repouso por 12 h a -15 °C. O precipitado foi recuperado, sendo que este variou com a razão de extrato bruto:acetona, ou seja, para as razões 1:1 e 1:2 verificou-se que a quantidade de precipitado recuperado foi mais reduzida do que para as razões 1:4 e 1:6. Este facto foi evidenciado pela cor dos coalhos apresentados na figura 3, pois quanto maior a quantidade de precipitado recuperado mais escuro foi o coalho obtido.
Figura 3- Coalhos obtidos por precipitação com acetona na razão 1:1, 1:2, 1:4 e 1:6 (da esquerda
Portanto, a avaliação visual dos coalhos demonstrou que à medida que o valor da concentração de acetona aumentava, o sobrenadante obtido ficava mais claro e a altura (quantidade) do precipitado aumentava.
No caso da precipitação com etanol, após a adição do solvente o sistema foi mantido em repouso over night a -15 °C. O precipitado foi recuperado, sendo que, também variou com a razão de extrato bruto:etanol. No entanto, para a razão 1:1 a quantidade de precipitado obtido, após 12 h em repouso, foi insignificante, como se pode verificar na figura 4 a), acabando mesmo por se dissolver aquando da remoção do sobrenadante. Assim, a não obtenção de precipitado para a razão 1:1, poderá ser explicada pela desnaturação das proteínas no decorrer da aplicação desta técnica, pois geralmente é efectuada a temperaturas abaixo dos 0 °C, dado que a temperaturas mais altas os solventes tendem a desnaturar proteínas. Como tal, a solução extrato bruto:etanol deve ter sido sujeita a temperaturas acima de 0 °C, conduzindo a uma precipitação residual de proteína para a razão 1:1.
Para os sistemas restantes foi possível recuperar o precipitado formado, sendo que foi para a razão 1:6 que se verificou uma quantidade de precipitado mais elevada. Este facto pode ser comprovado pela cor dos coalhos apresentados na figura 4 b), pois quanto maior foi a quantidade de precipitado recuperado mais escuro foi o coalho obtido.
a)
b)
Figura 4- a) Precipitado obtido para o sistema extrato bruto:etanol na razão 1:1, após 12 h em repouso. b) Coalhos obtidos por precipitação com etanol na razão 1:2, 1:4 e 1:6 (da esquerda para a direita) e
4.2.
Conteúdo em proteína dos coalhos de origem vegetal
O conteúdo em proteínas, determinado pelo método de Lowry, dos coalhos de origem vegetal obtidos pela precipitação com acetona e etanol, para as várias razões de extrato enzimático bruto:solvente, encontra-se apresentado na tabela 2.
Tabela 2- Concentração de proteínas dos coalhos líquidos obtidos pela precipitação com acetona e etanol variando as razões de extrato bruto:solvente
O conteúdo de proteína de uma preparação enzimática está diretamente relacionado com a probabilidade de encontrar uma maior quantidade de enzimas coagulantes do leite, e por sua vez, encontrar uma maior quantidade de enzimas implica o aumento do poder coagulante, que conduzirá a uma diminuição do tempo de coagulação do leite.
A precipitação de proteínas de extrato bruto com acetona apresenta uma concentração de proteínas em solução inferior à precipitação de proteínas com etanol.
Os resultados apresentados na tabela 2 revelam ainda que a concentração de proteína total varia proporcionalmente com a razão de extrato bruto:solvente, pois quanto maior foi a razão de solvente utilizado maior foi a proteína total quantificada. Este facto verifica-se pois a acetona e o etanol possuem uma constante dielétrica menor que a da água, aumentando assim a atração entre as moléculas proteicas, conduzindo à precipitação das mesmas.
Claramente o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:6 apresenta uma quantidade de proteínas maior, com 4,468 g/L, do que o coalho obtido pela precipitação com acetona, com 1,418 g/L.
Razão de extrato
bruto:solvente Proteína total (g/L) ACETONA Proteína total (g/L) ETANOL
1:1 0,198 -
1:2 0,301 0,805
1:4 0,901 2,086
4.3.
Atividade Coagulante e Proteolítica
Na tabela 3 e 4 encontram-se apresentadas as atividades coagulante e proteolítica dos coalhos obtidos pela precipitação com acetona e etanol, respectivamente. Os resultados determinados para a razão entre a atividade coagulante e proteolítica (R) também são apresentados na tabela 3 e 4.
Tabela 3- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos pela
precipitação com acetona, variando a razão de extratobruto:acetona
A atividade coagulante foi determinada pela medição do tempo de formação dos primeiros coágulos, o que não foi possível no caso do coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:1, dado que a adição deste coalho ao leite não originou a formação de partículas em suspensão. Relativamente à atividade proteolítica este coalho apresentou um valor residual (0,079 UAP/mL), que pode estar associado à clivagem de alguma ligação peptídica, exceptuando a ligação Phe105-Met106, ou à presença de alguma partícula em suspensão.
Um coalho adequado deve possuir intensa atividade coagulante e baixa atividade proteolítica para minimizar a dissolução do coágulo, como tal, pela análise dos restantes resultados é possível constatar que o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6 apresentar maior atividade coagulante (86,44 UAC/mL) e a atividade proteolítica menor (0,841 UAP/mL) foi conseguida para o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:2.
A Tabela 3 também mostra os resultados obtidos para as determinações de R para as várias razões de extrato bruto:acetona. Nota-se que em todas as razões o valor de R foi maior que 1, ou seja, a atividade coagulante foi maior que a proteolítica.
Razão de extrato
bruto:acetona Atividade Coagulante (UAC/mL) Atividade Proteolítica (UAP/mL) R
1:1 - 0,079 -
1:2 32,54 0,841 38,68
1:4 57,74 1,181 48,91
Dado que, a razão entre atividade coagulante e proteolitica (R) é usada como um índice para justificar a adequabilidade de um extrato enzimático, quanto maior for o seu valor, melhor. Portanto, a análise da tabela 3 revela que o melhor coalho foi o obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6, pois este possui o maior valor de R (49,2).
Tabela 4- Atividades coagulante e proteolítica, razão entre as atividades (R) dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol, variando a razão de extratobruto:etanol
Relativamente aos resultados dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol, apresentados na tabela 4, é possível constatar que o coalho que apresenta maior atividade coagulante foi o obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4 (122,66 UAC/mL) e o que possui menor atividade proteolítica foi o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:2 (0,963 UAP/mL).
No caso dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol, também se verifica que para as várias razões de extrato bruto:etanol o valor de R foi sempre maior que 1, ou seja, a atividade coagulante foi superior à proteolítica.
A análise da tabela 4 revela ainda que o melhor coalho foi o obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4, pois este possui o maior valor de R (60,32). Portanto, foram necessários quatro volumes de etanol para um volume de extrato bruto para obter uma boa precipitação.
Os resultados referentes aos coalhos obtidos pela precipitação com acetona foram insatisfatórios quando comparados com os dados do etanol, pois utilizando o etanol como solvente atingem-se valores mais elevados de R.
Razão de extrato
bruto:etanol Atividade Coagulante (UAC/mL) Atividade Proteolítica (UAP/mL) R
1:2 38,20 0,963 39,65
1:4 122,66 2,033 60,32
4.4.
Poder Coagulante dos Coalhos de Origem Vegetal
O poder coagulante é um dos fatores mais importantes na produção queijo, em termos de qualidade e desempenho, dado que expressa a capacidade de coagulação do leite. Os resultados do poder coagulante de cada um dos coalhos de origem vegetal obtidos pela precipitação com acetona e etanol, para as várias razões de extrato enzimático bruto:solvente, encontram-se apresentados na tabela 5.
Tabela 5- Resultados do poder coagulante dos coalhos líquidos de origem vegetal obtidos pela precipitação com acetona e etanol variando as razões de extrato bruto:solvente
A comparação dos resultados relativos ao poder coagulante dos coalhos obtidos pela precipitação com acetona (1:595, 1:875 e 1:1416 g/mL) com os resultados relativos ao conteúdo de proteína das mesmas amostras (0,301, 0,901 e 1,418 g/L) revelaram que quanto maior o conteúdo de proteínas maior o poder coagulante do coalho. De salientar ainda, que para o coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:1, que possui um conteúdo em proteína de 0,198 g/L (Tabela 2), não foi possível obter o valor do poder coagulante, pois após a adição deste coalho ao leite não ocorreu a formação de coágulos. Sendo assim, pode-se afirmar que as proteínas precipitadas pela acetona na razão 1:1 não apresentavam capacidade de coagulação, ou seja, este coalho não possuía proteases aspárticas ou então possuía-as numa quantidade residual, incapaz de provocar a coagulação do leite.
No caso dos resultados relativos ao poder coagulante dos coalhos obtidos pela precipitação com etanol (1:752, 1:1624 e 1:1134 g/mL), não se verifica a mesma tendência apresentada para os coalhos obtidos pela precipitação com acetona, pois o coalho que apresenta maior conteúdo em proteína (4,469 g/L) não corresponde ao coalho que possui maior
Razão de extrato
bruto:solvente Poder coagulante (g/mL) ACETONA Poder coagulante (g/mL) ETANOL
1:1 - -
1:2 1:594,9 1:751,6
1:4 1:875 1:1623,8
poder coagulante. Logo, um maior conteúdo em proteínas nem sempre implica uma maior quantidade de enzimas coagulantes, responsáveis pelo aumento do poder coagulante.
A análise da tabela 5 revela ainda que os solventes usados na razão 1:1, não são capazes de precipitar as proteases aspárticas responsáveis pela coagulação do leite, pois a adição destes coalhos não induziu qualquer alteração no leite.
Portanto, os resultados, apresentados na tabela 5, para o poder coagulante dos coalhos enzimáticos indicam que o maior poder coagulante, 1:1624 g/mL, foi o do coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4, isto é, 1 g deste extrato enzimático vegetal é capaz de coagular 1,6 L de leite a uma temperatura de 30 °C em 40 min.
4.5.
Cinética enzimática
A determinação dos parâmetros cinéticos, apresentados na tabela 6, foi conseguida pela linearização de Lineweaver-Burk, com posterior ajuste a um modelo não linear. Esta determinação foi efectuada apenas para os dois coalhos que se revelaram mais eficientes, no caso da precipitação com acetona, o mais eficaz foi o coalho obtido na razão 1:6 e no caso do etanol foi o obtido na razão 1:4.
Tabela 6-Parâmetros cinéticos (Km e Vmáx) determinados para os coalhos obtidos pela precipitação com acetona na razão 1:6 e pela precipitação com etanol na razão 1:4
Como pode ser observado na tabela 6, o valor de Km para o coalho obtido pela precipitação com etanol na razão 1:4 (38 g/L) é maior do que o atingido para o coalho obtido pela precipitação com acetona (18 g/L), o que indica uma maior afinidade deste último em relação ao substrato. Isso denota que as proteases do coalho obtido pela precipitação com acetona na razão 1:6 são menos específicas, pois apresentam mais opções de sítios de hidrólise na caseína.
Km (gCaseína/L) Vmáx (gGMP/L.min)
Coalhoacetona 1:6 18 ± 11 0,239 ± 0,048