5.1. Experimento “A”
Os isolados de fungos predadores testados, M. Sinense (SF-139) e M.
appendiculatum (CGI), foram capazes de suportar as condições adversas
impostas durante o trânsito pelo trato gastrintestinal dos bezerros.
Conídios foram primeiramente visualizados, ao 140 dia de observação,
nas placas dos tempos 12, 18, 24 e 48 horas para o isolado CGI e do tempo 12 horas para o isolado SF-53. A presença de conídios em todos os tempos
testados foi alcançada pelo isolado M. appendiculatum ao 150 dia de
avaliação, neste momento, o fungo M. sinense era passível de confirmação apenas nos tempos 12, 18 e 24 horas, manifestando-se nos demais tempos,
somente, ao 160 dia.
Não foi detectada a presença de fungos nematófagos nas placas pertencentes ao tratamento controle.
O tempo médio necessário para a passagem de material fúngico pelo sistema digestivo dos ruminantes é muito variável. WALLER et al. (1994) registraram o período de 24 horas, trabalhando com ovinos. MELO et al. (2003) encontraram o fungo M. thaumasium em placas confeccionadas com fezes de caprinos coletadas 21 e 24 horas após a inoculação. ARAÚJO et al. (1999) administraram por via oral a bezerros micélio e conídios de dois isolados de A. robusta, um isolado de A. conoides, um isolado de M.
ellypsosporum e um isolado de M. thaumasium. Os autores relataram a
observação dos fungos nas placas de Petri preenchidas com fezes amostradas às 15, 18, 21, 24, 48, 72, 96 e 110 horas após o fornecimento oral. O presente estudo demonstrou que os isolados SF-53 e CGI foram capazes de atravessar o sistema digestivo de bezerros em 12 horas, sendo eliminados por estes até 96 horas após administração oral.
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Neste experimento, os isolados SF-53 e CGI mantiveram a capacidade de predar larvas infectantes de Cooperia sp. e Haemonchus sp. após atravessarem o trato gastrintestinal de bezerros. Esta habilidade predatória já havia sido comprovada por GOMES et al. (1999), ao perceberem um comportamento patogênico semelhante dos isolados, aqui testados, frente a larvas infectantes de Cooperia punctata durante 7 dias de estudo. Quando estes fungos foram testados com larvas infectantes de H. placei, o isolado SF-53 exibiu uma patogenicidade ligeiramente superior ao isolado CGI.
A TABELA 1 exibe os valores médios do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e Haemonchus sp. recuperadas das placas de Petri nos respectivos tempos e diferentes tratamentos avaliados neste experimento. Observou-se que os últimos tempos avaliados (72 e 96 horas) foram aqueles que apresentaram os menores números médios de larvas infectantes recuperadas, significando uma maior atividade predatória. MOTA (2002) relatou que o pico de atividade predatória dos isolados de A.
robusta e M. thaumasium submetidos a diferentes métodos de estocagem
ocorreu 24 horas depois da aplicação oral de 20 g de micélio.
Os períodos de maior eliminação fúngica por parte dos animais relacionam-se diretamente aos tempos de maior predação larval dentro de um mesmo tratamento. O tipo e a quantidade de alimento fornecido durante o experimento, assim como, a dose de fungo testada, podem eventualmente influenciar a dinâmica de eliminação fúngica. Não existe atualmente consenso sobre uma dose fúngica ideal (FERNÁNDEZ et al., 1999). Neste ensaio científico utilizaram-se 100 g de micélio fresco para cada isolado testado, durante a produção da massa micelial, o isolado CGI sobressaiu-se comparado ao isolado SF-53 em características desejáveis no processo industrial de produção, apresentando maior velocidade de crescimento em meio líquido GPY e menor susceptibilidade a contaminações.
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TABELA 1 - Valores médios do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e
Haemonchus sp. recuperadas das placas de Petri preenchidas com fezes de
bezerros amostradas nos tempos 12, 18, 24, 48, 72 e 96 horas após os tratamentos com o isolado M. sinense (SF-53) e o isolado M.appendiculatum (CGI)
TEMPO (horas)
TRATAMENTO 12 18 24 48 72 96
SF-53 36,0 b 26,0 b 65,7 a 24,3 a 15,0 b 14,0 a
CGI 101,3 b 146,3 a 45,0 a 25,7 a 25,7 a b 12,0 a
CONTROLE 278,7 a 153,3 a 140,0 a 111,0 a 140,3 a 90,7 a
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey.
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do gênero Arthrobotrys foram cultivados, resultou na presença dos fungos nas fezes das ovelhas e na redução do número de larvas infectantes recuperadas das culturas de fezes (GRUNER et al., 1985; PELOILLE, 1991). Outros estudos (LARSEN et al., 1992; GRØNVOLD et al., 1993) demonstraram reduções significativas do número de larvas infectantes extraídas da cultura de fezes e de amostras de pastagens onde bezerros foram mantidos, alimentados com 200 g de cereais contendo Arthrobotrys spp. ou D. flagrans. WALLER et al. (2001) fornecendo diariamente a ovelhas 5 g de grãos colonizados por D. flagrans eliminaram virtualmente o número de larvas das coproculturas.
A variação das curvas de recuperação de larvas entre tratamentos pode sofrer ainda a influência da afinidade predatória dos fungos aos nematóides testados. A solução de nematóides utilizada neste experimento apresentou proporções larvais de 58% e 42% para Cooperia sp. e
Haemonchus sp. respectivamente. Uma vez que os isolados SF-53 e CGI
apresentam comportamento patogênico parecido para os parasitas utilizados, os resultados dos tratamentos presentes na TABELA 1 devem ter sofrido pouca influência desse aspecto. GOMES et al. (2001) recordam, no entanto, que os estudos in vitro podem superestimar o potencial dos fungos, uma vez que as placas de Petri limitam as opções de escape dos nematóides.
Nota-se através das curvas de regressão dispostas na FIGURA 1 que os isolados fúngicos (SF-53 e CGI) apresentaram comportamentos semelhantes ao longo do tempo, diferindo claramente do tratamento controle através do interstício gerado no gráfico, entre as linhas de tendências, representativo da ação predatória dos fungos. Contudo, é possível que a proximidade estatística de dados exibida pelos tratamentos fúngicos (SF-53 e CGI) testados neste trabalho, derive do fato destes isolados terem sido eliminados em quantidades pouco discrepantes para
24 N Ú M E R O D E LA R V A S P O R P LA C A y = 564,14*h-0,3878 R2 = 0,701 y = 1794,4*h-1,0613 R2 = 0,8635 y = 48,345e-0,0137*h R2 = 0,6371 0 50 100 150 200 250 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 TEMPO (h) NÚMERO DE LA R VAS SF-53 CGI CONTROLE
Potência (CONTROLE) Potência (CGI) Expon. (SF-53)
FIGURA 1- Estimativa média do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e Haemonchus sp. recuperadas das placas de Petri nos tratamentos com o isolado M. sinense (SF-53), isolado M.appendiculatum (CGI) e CONTROLE em função do tempo.
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todos os tempos analisados e por possuírem semelhante atividade predatória para as larvas testadas.
Conclui-se que os isolados de fungos predadores M. sinense (SF-53) e M. appendiculatum (CGI) constituem opções igualmente eficientes para posteriores testes de campo, no intuito de angariar maior conhecimento a respeito destes microorganismos para emprega-los, futuramente, no controle biológico de nematóides gastrintestinais de ruminantes.
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5.2. Experimento “B”
No presente estudo não houve evidências de que o fungo predador M.
sinense (SF-139) tenha sido capaz de atravessar o trato gastrintestinal de
bezerros após administração oral. As observações diárias das placas de todos os tempos não notificaram a presença de nenhuma estrutura reprodutiva de característica morfológica compatível com a do fungo pesquisado.
Não foi detectada a presença de fungos nematófagos nas placas pertencentes ao tratamento controle.
A habilidade deste isolado em predar larvas infectantes de Cooperia sp. e Haemonchus sp. já tinha sido comprovada por trabalhos anteriores (GOMES et al.,1999).
As TABELAS 2 e 3 compreendem os dados do número médio de larvas de Cooperia sp. e Haemonchus sp. recuperadas das coproculturas e das placas respectivamente nos diferentes tratamentos em tempos distintos, observa-se que apenas o tempo de 48 horas para as coproculturas apresentou diferença.
Os bezerros utilizados neste experimento apresentaram OPG médio idênticos de 1100, esta intensidade coincidente de parasitismo desejada na metodologia foi determinada pelo método modificado de GORDON e WHITLOCK (1939) descrito por LIMA (1989), porém, como todo exame microscópico quantitativo ele é incapaz de expressar a real infecção do hospedeiro, prestando-se apenas para determinar a intensidade do parasitismo (HOFFMANN, 1987). Além do número de parasitos existentes, diversos outros fatores ainda influenciam a quantidade de ovos eliminados nas fezes, como por exemplo: hora do dia da coleta, nutrição e imunidade animal, relação de parasitos machos e fêmeas, idade do parasito e patogenicidade das espécies de parasitos (HOFFMANN, 1987). Estas
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diversas variáveis explicam uma possível eliminação de ovos inconstante TABELA 2 - Valores médios do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e
Haemonchus sp. recuperadas das coproculturas realizadas com fezes de bezerros
amostradas nos tempos 12, 18, 24, 48, 72 e 96 horas após o tratamento com o isolado M. sinense (SF-139).
TEMPO (horas)
TRATAMENTO 12 18 24 48 72 96
SF-139 559,6 a 656,8 a 907,0 a 1471,2 b 1458,0 a 2063,2 a
CONTROLE 421,8 a 1225,0 a 999,0 a 3047,4 a 1625,8 a 2585,8 a
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey.
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TABELA 3 - Valores médios do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e
Haemonchus sp. recuperadas das placas de Petri preenchidas com fezes de
bezerros amostradas nos tempos 12, 18, 24, 48, 72 e 96 horas após o tratamento com o isolado M. sinense (SF-139)
TEMPO (horas)
TRATAMENTO 12 18 24 48 72 96
SF-139 421,7 a 746,7 a 287,3 a 349,0 a 386,3 a 518,7 a
CONTROLE 198,0 a 365,3 a 639,7 a 719,0 a 514,0 a 899,0 a
As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste Tukey.
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por parte dos animais do experimento, que se refletiu mais tarde nos dados de número de larvas infectantes recuperadas, permitindo até que ocorresse uma diferença, entre o animal tratado (SF-139) e o animal controle, no tempo 48 horas das coproculturas (TABELA 2).
O isolado M. sinense (SF-139) já havia sido avaliado por ARAÚJO et al. (1999), quando administrado por via oral a bezerros na forma de
conídios, em dose de 20x106, e na forma de micélio com presença de
armadilha (100 g) e sem presença de armadilha (100 g). Ao final do trabalho, os autores constataram que o fungo não passou pelo sistema digestivo dos animais. Muitos isolados fúngicos sucumbem durante o trânsito pelo trato alimentar dos ruminantes devido as severas condições térmicas, enzimáticas e anaeróbias impostas a eles (GRØNVOLD et al., 1993; LARSEN et al., 1992, 1998). Os resultados contraditórios entre isolados de uma mesma espécie de fungo com respeito à habilidade de suportar a passagem pelo sistema digestivo podem ser explicados pela existência de características diferentes inerentes às linhagens testadas (GRØNVOLD et al., 1996). No presente trabalho, dois isolados da mesma espécie (M. sinense) foram testados, o isolado SF-53 resistiu à passagem pelo trato digestivo dos bezerros, diferentemente do isolado SF-139 que não obteve êxito. Uma variabilidade genética entre as amostras, pode, naturalmente, determinar características físicas importantes relacionadas à capacidade de resistência. LARSEN (1999) credita os excelentes resultados obtidos na passagem do fungo D. flagrans pelo sistema digestivo de ruminantes à sua capacidade de produzir muitos esporos resistentes, de parede espessa, conhecidos por clamidósporos. Esta capacidade justificou também a sua melhor performance, quando comparado a fungos do gênero
Arthrobotrys que possuem conídios de parede fina (LARSEN et al., 1992;
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sinense é capaz de produzir clamidósporos, e apesar de existirem
dificuldades na tentativa de se desenvolverem metodologias eficientes para a produção massal destas estruturas (MOTA, 2002). Um trabalho visando determinar as condições ideais para a produção de clamidósporos destes fungos, seria de grande valor científico.
As curvas de regressão e suas respectivas equações com coeficientes testados, dispostas nas FIGURAS 2 e 3, permitem evidenciar o comportamento irregular dos tratamentos ao longo do tempo.
31 N Ú M E R O D E LA R V A S P O R C O P R O C ULT U R A y = 121,2**h0,6137 R2 = 0,9654 y = 101,66**h0,7339 R2 = 0,7052 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 TEMPO (h) NÚMERO DE LA R VAS
SF-139 CONTROLE Potência (SF-139) Potência (CONTROLE)
Figura 2- Estimativa média do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e
Haemonchus sp. recuperadas das coproculturas nos tratamentos com o isolado M. sinense (SF-139) e CONTROLE em função do tempo.
32 N Ú M E R O D E LA R V A S P O R P LA C A y = 72,354**h0,5446 R2 = 0,6682 y = 0,1123(0,05369)h2 - 11,721(0,05057)h + 623,21 R2 = 0,1673 0 150 300 450 600 750 900 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 TEMPO (h) NÚMERO DE LA R VAS
SF139 CONTROLE Potência (CONTROLE) Polinômio (SF139)
Figura 3- Estimativa média do número de larvas infectantes de Cooperia sp. e
Haemonchus sp. recuperadas das placas de Petri nos tratamentos com o
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