Baseado nos crescentes estudos envolvendo a GG e a LAP como biomateriais, observou uma oportunidade para o desenvolvimento de hidrogéis para aplicação na medicina utilizando a bioimpressão como ferramenta.
O interesse na obtenção de hidrogéis de GG e LAP é aproveitar a semelhança estrutural com glicosaminoglicanos da matriz celular da GG e em relação a LAP a capacidade de dispersão estável e principalmente a modificação da reologia do hidrogel, sendo capaz de encontrar o hidrogel ideal para bioimpressão.
A figura 15 apresenta a fotografia dos hidrogéis GG∕LAP obtidos. Os hidrogéis apresentaram-se homogêneos e transparentes em todas as formulações
Figura 15: Amostra de hidrogéis (a) GOMA GELANA PURA, (b) GG/LAP-90/10, (c) GG/LAP-50/50, (d) GG/LAP-10/90, (e) LAPONITA PURA
Fonte: Própria
Com o intuito de facilitar as caracterizações morfológicas, estruturais e térmicas dos hidrogéis compósitos, os mesmos foram liofilizados. A figura 16(a-e) apresenta fotografias das amostras após o processo de liofilização.
Figura 16: Hidrogéis liofilizados (a) GOMA GELANA PURA, (b) GG/LAP-90/10, (c) GG/LAP-50/50, (d) GG/LAP-10/90, (e) LAPONITA PURA.
Fonte: Própria
A figura 17 apresenta imagens de MEV dos compósitos GG/LAP. Na figura 17a observa-se uma estrutura compacta da amostra de laponita pura e presença de pequenos agregados. Nas micrografias das amostras que contem GG e LAP (figuras 17b-e), observa-se uma estrutura mais porosa e uma boa dispersão da laponita nos hidrogéis compósitos. Resultados semelhantes foram observados por Pacelli et al. (2016)
GOMA GELANA PURA GG/LAP-90/10
GG/LAP-50/50 GG/LAP-10/90
que relatou a preparação de hidrogéis nanocompósitos baseados em metacrilato, goma gelana e laponita para aplicações em liberação de fármacos.
Figura 17: Imagens de MEV dos hidrogéis: (a) LAPONITA PURA, (b) GG/LAP-10/90, (c) GG/LAP-50/50, (d) GG/LAP-90/10, (e) GOMA GELANA PURA.
Fonte: Própria
A Figura 18 apresenta os espectros de espectroscopia vibracional na região do infravermelho dos compósitos GG/LAP, Laponita pura e Goma Gelana pura liofilizadas.
Os principais atributos que caracterizam a amostra de GG pura (figura 18a) aparecem no espectro em 3390 cm-1, referente ao estiramento O-H dos grupos hidroxilas, em 2920 cm-1 referente ao estiramento C-H, em 1600 cm-1 referente ao estiramento assimétrico do grupo COO-, em 1398 cm-1 referente ao estiramento simétrico de COO-, em 1018 cm-1 referente ao estiramento do grupo C-O (BACELAR et al., 2016).
O espectro da amostra de laponita pura apresenta bandas vibracionais características em 3649 cm−1 e 3450 cm−1 (estiramento O-H da rede), 1636 cm−1 (deformação angular O-H) e 1011 cm−1 (deformação Si-O) (CAI et al., 2016).
Com relação às amostras compósitas, figura 18 (b-d), os espectros revelaram que não houve o surgimento de nenhuma nova banda, e que os espectros são formados basicamente pelo somatório das bandas presentes na GG e laponita.
Figura 18: Espectrometria na região do infravermelho: a) GOMA GELANA PURA, b) GG/LAP-90/10, c) GG/LAP-50/50, d) GG/LAP-90/10, e) LAPONITA PURA.
Fonte: Própria
A figura 19 apresenta as curvas TGA/DTG dos compósitos GG/LAP.
A curva da TG da GG (Fig. 19a) apresenta uma perda de massa de aproximadamente 10% na faixa de temperatura entre 35-100ºC. Essa perda de massa é confirmada por um evento endotérmico observado na curva DSC, e pode ser atribuída à desidratação da GG, como, por exemplo, evaporação de água adsorvida. Um evento bem acentuado com grande perda de massa é observado na faixa de temperatura que compreende o intervalo de 200ºC a 300 ºC, e com máximo em 245ºC como demonstrado na curva DTG, o qual está relacionado a processos de degradação da GG como despolimerização.
A curva da TGA da GG (Fig. 19e) apresenta uma perda de massa de aproximadamente 10% na faixa de temperatura entre 35-100ºC. Um evento bem acentuado de perda de massa é observado na faixa de temperatura que compreende o intervalo de 200ºC a 300ºC, com máximo em 245ºC como demonstrado na curva DTG.
Para os compósitos, observam dois eventos principais. Um entre 35-150ºC com perda de massa de aproximadamente 7 % correspondente a evaporação de água de superfície. Na faixa de temperatura entre 200ºC a 300ºC observa-se uma perda de massa acentuada referente a decomposição da GG. De maneira geral, não houve mudança na estabilidade térmica da GG com a presença de laponita, apenas para a amostra que contém maior proporção de laponita, onde observa-se um significativo aumento da estabilidade térmica, com aumento da temperatura de degradação de 245°C para 280°C Além disso, as curvas TGA apresentam diferença no resíduo, que como esperado, aumenta com o aumento da concentração de laponita e corrobora com os valores estabelecidos na preparação das amostras, como pode ser observado na tabela 3.
Figura 19: TGA dos hidrogéis - (a) LAPONITA PURA, (b) GG/LAP- 10/90, (c) GG/LAP- 50/50, (d) GG/LAP- 90/10, (e) GOMA GELANA PURA.
(a) (b)
(c) (d)
(e)
Tabela 3: Dados das curvas TGA dos hidrogéis laponita pura, GG/LAP 90/10, GG/LAP 50/50, GG/LAP 10/90, goma gelana pura
Amostras Tmax (ºC) Resíduo (%)
Goma Gelana Pura 245 29
GG/LAP 90/10 245 35
GG/LAP 50/50 247 69
GG/LAP 10/90 280 85
Laponita Pura - 89
Fonte: Própria
A figura 20 apresenta os difratogramas da GG, LAP de das compósitos GG/LAP. Na difratometria de Raio X da amostra de goma gelana pura pode ser observado um pico de menor intensidade em 2θ=21,80 (d=0,141nm) relacionado ao plano cristalográfico (200), refletindo o plano da unidade do polimanuronato, resultados semelhantes aos reportados por (SUNDARRAJAN et al., 2012).
O difratograma de raio-x da Laponita pura apresenta picos em 2 = 6,04º, 19,62º, 34,53º correspondentes as distância interplanares de 14.2, 4.50, 2.56 e 1.51 Å, e se referem ao planos basais 001, 110, 200 e 060, respectivamente (MAHDAVINIA et al., 2015).
Com o aumento da concentração de GG nas amostras com LAP, ocorre uma redução da cristalinidade da LAP e da GG, alterando a organização estrutural original levando assim a uma redução do espaçamento basal, podendo-se observar um alargamento e diminuição de intensidade do pico em 21,80°.
Figura 20 - Difratogramas de Raios-X das amostras GOMA GELANA PURA (preto), GG/LAP-90/10(vermelho), GG/LAP-50/50(verde), GG/LAP-10/90 (azul) e LAPONITA PURA (azul claro).
Fonte: Própria
Para o desenvolvimento dos hidrogéis com características ideais para bioimpressão 3D é fundamental a análise das propriedades reológicas do material. Com estudo da reologia é possível prever o comportamento do hidrogel ou biotinta no momento da bioimpressão (AKIRA; LUIS, 2018).
Para a bioimpressão do hidrogel, o mesmo deve possuir características tixotrópicas, apresentando um comportamento não newtoniano, onde quanto maior a tensão de estresse menor será sua viscosidade com tempo razoável de recuperação (DÁVILA; D’ÁVILA, 2017).
Com medidas de viscosidade de cisalhamento em estado estacionário foi possível avaliar a capacidade de impressão dos hidrogéis caracterizados, gerando um gráfico de viscosidade em função da taxa de cisalhamento, como pode ser observado na figura 21.
Figura 21 - Viscosidade (𝜂) em função da taxa de cisalhamento (𝛾): LAPONITA PURA, GG/LAP- 10/90, GG/LAP- 50/50, GG/LAP- 90/10, GOMA GELANA PURA.
Fonte: Própria
Os hidrogéis Laponita Pura e GG/LAP-10/90 apresentaram características newtonianas, apresentando características líquidas. Para os demais hidrogéis observa- se comportamento mais sólido dos hidrogéis, que estaria associado a reticulação física das cadeias poliméricas de GG entre as plaquetas da LAP (MIYOSHI; TAKAYA; NISHINARI, 1996). Nota-se também que a viscosidade das amostras diminui com a adição LAP ( tabela 4), conforme já reportado por Adrover et al.(2019).
Foram analisadas as curvas de viscosidade utilizando o modelo de Ostwald (1913) onde n é o índice da lei de potência, definindo o comportamento da viscosidade e o m é o índice de consistência que está relacionada à grandeza da viscosidade. Sendo assim Morrison (2001) definiu os seguintes termos: se n > 1 é dilatante, se n = 1 é newtoniano e para ser pseudoplástico n < 1.
V is c os id ad e 𝜂 ( P a.s ) Taxa de cisalhamento 𝛾 (1/s)
Tabela 4 - Parâmetros de ajuste do modelo de viscosidade Ostwald-de Waele
Amostras m (Pa.s-1) n (-) R2
Goma Gelana Pura 3364,15 -1,555 0,9829
GG/LAP 90/10 136,059 -0,904 0,9993
GG/LAP 50/50 30,063 -0,806 0,9999
GG/LAP 10/90 0,4093 -0,426 0,9999
Laponita Pura 0,0588 1,323 0,9997
Fonte: Própria
Observa-se que na tabela 4 o índice de consistência (m) diminui significativamente com a adição de LAP, sendo assim a LAP está relacionada diretamente a modificação reológica do hidrogel, modificando o material e o deixando menos viscoso. Os hidrogéis GG/LAP 90/10 e GG/LAP 50/50 apresentaram propriedades satisfatórias para aplicação em bioimpressoras 3D do modelo de microextrusão, visto em estudo de Bakarich et al. (2014) que apresenta índices de m na faixa de 20 a 150 Pa.s-1 (BAKARICH et al., 2014). Para analisar a processabilidade dos hidrogéis, as soluções foram carregadas na seringa a 40ºC. A concentração de GG pura resultou uma solução altamente viscosa e causou entupimento da agulha da seringa. Uma alta viscosidade impede a formação de filamento para a impressão. Entretanto, quando a concentração de GG é muito baixa, ocorre uma diminuição na viscosidade que não permite a formação de um filamento ideal para bioimpressão. Da mesma forma, o hidrogel de LAP Pura mostrou-se pouco viscoso, não sendo capaz de formar um filamento no decorrer da impressão (MALDA et al., 2013). A adição da LAP nos hidrogéis de GG induz uma diminuição da viscosidade, onde a LAP interage com as cadeias de GG, diminuindo a reticulação física das cadeias poliméricas de GG e causando a formação de um gel menos rígido (PACELLI et al., 2018).
Para se ter uma qualidade de impressão, deve-se optar a utilizar materiais que exibem uma relação linear entre viscosidade e taxa de cisalhamento. Deste modo, é fundamental encontrar relações entre viscosidade, tixotropia, taxas de cisalhamento e a velocidade de impressão (RUZICKA; ZACCARELLI, 2011).
Utilizando o cabeçote de microextrusão por pistão desenvolvido nesse trabalho foram selecionados os hidrogéis seguindo os dados mostrados pela reologia, onde observou-se que os hidrogéis GG/LAP-90/10 e GG/LAP-50/50, possuem características
ideias para bioimpressão 3D, conforme a tabela dos parâmetros de ajuste do modelo de viscosidade dos estudos de Ostwald-de Waele Bakarich et al. (BAKARICH et al., 2014; OSTWALD, 1913).
Para validação dos hidrogéis e da bioimpressora, visando possíveis aplicações em engenharia tecidual, foi realizada a impressão de um scaffold, sem a utilização de um reticulante, para avaliar se a estrutura sofreria colapso. O scaffold foi projetado na forma de um cilindro, com o diâmetro de 10,75 mm e espessura de 5 mm, e fatiado com o software Slic3r, com a configuração apresentada previamente pelo autor (Fig.22). A amostra GG/LAP-50/50, ao ser impressa, colapsou no meio da impressão. O scaffold impresso utilizando o hidrogel GG/LAP-90/10 (figura 22) demonstrou estabilidade estrutural semelhante a hidrogéis de diversos compósitos aos que vem sendo relatados na literatura (LEPPINIEMI et al., 2017; MOUSER et al., 2016; TALLIA, 2016; WU et al., 2018).
Figura 22: Impresso em impressora home made usando cabeçote de microextrusão