4. 1. SELEÇÃO DE INICIADORES
Foram selecionados somente os iniciadores que apresentaram 3 ou mais bandas polimórficas e boa resolução. Através deste critério a Tabela 04 mostra o desempenho dos kits de iniciadores em relação ao critério de qualidade de amplificação.
Tabela 4. Resultados obtidos na seleção de iniciadores. Kit Iniciadores Monomórficos Iniciadores polimórficos Iniciadores com má amplificação
(ou com rastros)
Iniciadores s/ amplificação
B 4 15 1 0
F 5 12 1 2
Q 5 10 5 0
Na Figura 02 pode ser visualizado um dos experimentos realizados para a seleção dos iniciadores. Neste exemplo foram utilizados, numa mesma PCR, três dos vinte iniciadores que compunham o kit Q. Como pode ser observado, cada iniciador apresenta um padrão de amplificação diferente.
Q5 Q6 Q7
Figura 02. Triagem do Kit Q. As setas indicam polimorfismos encontrados.
Com os 60 iniciadores utilizados, inicialmente, nos experimentos obteve-se um total de 192 bandas amplificadas, das quais 132 foram polimórficas, gerando 68,75 % de polimorfismo.
4.2 – REAÇÕES RAPD
Os iniciadores OPB-03, OPB-08, OPB-09, OPB-13, OPB-14, OPB-19, OPF-03, OPF-04, OPF-07, OPF-09, OPF-10, OPQ-05, OPQ-06, OPQ-07 e OPQ-09, que obtiveram o melhor desempenho quanto ao número de bandas, foram selecionados para realizar a análise RAPD em todas as amostras coletadas.
Um total de 109 marcadores RAPD, com tamanhos variando entre 450 pb a 2200 pb, foi gerado pelos 15 iniciadores utilizados, sendo todos polimórficos. O
número de fragmentos polimórficos por iniciador variou de 3 (OPB14) a 11 (OPB08 e OPF06), com média de 7,26 bandas por iniciador (Tabela 05).
Tabela 05. Número de bandas polimórficas, geradas por cada iniciador utilizado no presente estudo.
No. Iniciador No. de bandas polimórficas
1 OPB 03 09 2 OPB 08 11 3 OPB 09 07 4 OPB 13 07 5 OPB 14 03 6 OPB 19 07 7 OPF 03 05 8 OPF 04 08 9 OPF 07 06 10 OPF 09 04 11 OPF 10 06 12 OPQ 05 10 13 OPQ 06 11 14 OPQ 07 09 15 OPQ 09 06 TOTAL 109
Marques et al. (2004) avaliaram a similaridade entre grupos de avestruzes da Amazônia utilizando 13 iniciadores e, obtiveram bandas polimórficas que variaram de 01 a 11, com uma média de 5,85 bandas por iniciador. Resultado semelhante foi obtido por Godoy et al. (2005) quando realizaram o trabalho de variabilidade em sub- grupos de avestruzes, tendo com o maior e menor número de bandas polimórficas, respectivamente, 14 e 4 por iniciador.
Por sua vez, Bouzat (2001) pesquisou a estrutura genética de Emas (Rhea americana) com marcadores RAPD e encontrou um total de 54 polimorfismos utilizando 18 iniciadores. Considerando que esse número pode variar de acordo com a população estudada, os resultados obtidos estão dentro do esperado.
Como os trabalhos realizados variam quanto ao número de bandas polimórficas, existe a dúvida quanto ao número ótimo das mesmas para determinada análise. Assim, a análise de bootstrap dá maior segurança sobre o número de bandas adequadas para realizar estudos de variabilidade genética. Desta forma, foram realizadas análises de reamostragens, empregando-se as 109 bandas geradas nas 121 amostras. Os resultados obtidos encontram-se resumidos na Figura 03.
Houve uma relação direta entre o número de bandas e o valor de correlação dos valores da matriz de similaridade original com os das outras matrizes de similaridade, a partir das amostras dos diferentes números de bandas. A partir de 70 bandas, a estimativa de correlação apresentou alta magnitude (r=0,91), mas a soma dos quadrados dos desvios em relação às reamostragens (SQd=28,22) e o valor do estresse (estresse=0,27) ainda foram altos, o que é considerado por Kruskal (1964) como baixa consistência na associação das matrizes.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 20 40 60 80 100 120 Número de Bandas C or re la çã o r =0,99SQ= 1,25 E= 0,05
Figura 03. Resumo da análise de bootstrap.
Somente a partir de 100 bandas houve um bom ajuste entre os valores da matriz de similaridade original com os das outras matrizes de similaridade. Assim, para este número de bandas, a magnitude da correlação foi bem próxima do valor
máximo (r=0,99), apresentando alta confiabilidade, uma vez que cada reamostragem foi repetida 10.000 vezes. A soma de quadrados dos desvios (SQd) atingiu valor baixo 1,25 e o valor do estresse (E) de 0,05. Para Kruskal (1964) valores de estresse iguais ou inferiores a 0,05 representam um excelente indicativo de precisão, o que confirma o valor mencionado.
Como este trabalho gerou 109 bandas polimórficas para o marcador dominante (RAPD), estimando os complementos aritméticos das similaridades genéticas entre indivíduos, pode-se sugerir que as bandas polimórficas empregadas neste estudo sejam confiáveis para avaliar relações genéticas entre as amostras estudadas.
As estimativas de similaridades genéticas obtidas para os 121 indivíduos, a partir da matriz de Jaccard, estão presentes na Figura 04. Na análise entre pares de grupos, foi verificado que a maior e menor similaridade estão em torno, respectivamente, de 0,86 e 0,00, quando se comparam os indivíduos Av119 e Av 118 (Sj = 0,86), Av1 e Av92, Av3 e Av92, Av3 e Av101, Av4 e Av115, Av4 e 104 e Av6 com o Av119 (Sj = 0,00).
No que diz respeito à distribuição de freqüência das similaridades obtidas entre os 5.644 pares formados na matriz genética, pode-se verificar que 32,69 % dos pares ficaram incluídos nas classes com similaridades variando de 0,01 a 0,10, cujo ponto médio apresentou valor de 0,05. Nota-se que a maior porcentagem (85,59%) dos pares ficaram distribuídos nas três primeiras classes das extremidades e que a minoria deles (14,41%) apresentou similaridades variando de 0,21 a 1,00, fazendo com que o padrão de distribuição das classes mostrasse um perfil decrescente e depois tendendo a crescer, exibindo uma tendência de distribuição polinomial. A maior parte dos indivíduos obteve baixa similaridade.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 No. de pares 0,05 0,16 0,25 0,36 0,46 0,56 0,65 0,79 Classes de Similaridade
Figura 04. Distribuição de freqüência das estimativas de similaridades genéticas.
A Figura 05 mostra que os resultados apresentam elevada confiabilidade, pois o valor cofenético obtido foi alto e significativo (r=0,81, P < 0,0001). Valores de r superiores a 0,50 são considerados estatisticamente significativos (OLIVEIRA, 2005).
Figura 05. Teste de Mantel, onde mostra r = 0,81 e P<0,0001.
No dendrograma gerado, observa-se a formação de vários grupos, dos quais sessenta e sete deles foram delimitados pela similaridade genética média como
distintos (Figura 06). A maioria (63) dos grupos foi formada por um ou poucos indivíduos; os demais (03) agrupamentos foram constituídos por onze indivíduos. O individuo Av91 (proveniente do estado de Minas Gerais) apresentou 6 % de similaridade.
Os indivíduos apresentaram similaridade média de 0,49 (49 %), destacando-se como mais similares os indivíduos Av48 e Av49 (cerca de 83 %) provenientes do Maranhão e Av118 e Av119 (com 86 %), de Minas gerais. A população proveniente do Pará apresentou como menor similaridade 29 % e maior 69 %, tendo como indivíduos mais próximos o Av3 e Av16. A população do Maranhão apresentou grande diferença entre os indivíduos, a maior e menor similaridade entre os mesmos foi, respectivamente, de 83 % e 46 %. Os mais próximos foram Av48 e Av49.
A maior similaridade entre os indivíduos de Tocantins foi de 80% entre o Av27 e Av29; a menor similaridade foi de 27% entre Av37 e o grupo formado por Av26, Av27, Av28, Av29 e Av34.
Apesar da população de Minas Gerais ter apresentado a maior e menor similaridade deste estudo, não há diferenças significativas de similaridade entre os demais indivíduos dessa população. Das 39 amostras utilizadas neste trabalho, 24 apresentam-se formando dois grupos fechados, sem quaisquer indivíduos das outras populações. Os demais se encontram poucos similares entre si e com as demais amostras, exceto o Av84 que apresentou 43 % de similaridade com o Av80 que faz parte da população do Maranhão.
Percebe-se ainda na Figura 06 que há uma relação de similaridade de 60 % entre os indivíduos Av10, do Pará, com o Av50 do Maranhão.
Entre os indivíduos do Maranhão e Tocantins, a maior similaridade ocorreu entre os indivíduos Av36 e Av86 que foi de 58%.
Vale ressaltar que o número de amostras do estado de Tocantins foi bastante inferior as dos demais Estados envolvidos neste estudo, o que pode ter influenciado na relação de similaridade entre essa população e as demais.
Marques et al. (2004) estudando grupos de avestruzes oriundos de duas populações dos estados do Pará e Maranhão obteve similaridade entre 27 % e 83 %. Já Godoy et al. (2005) observaram que a similaridade variou de 42 % a 85,7 %, entretanto este último utilizou apenas 10 animais African Black para realização do referido trabalho.
Marques et al. (2004) encontraram 77,4 % de similaridade entre os indivíduos da população do Pará. A população do estado Maranhão apresentou diferença grande entre os indivíduos; segundo os autores, esses animais provavelmente são oriundos de diferentes origens.
Figura 06. Dendrograma gerado pelo método UPGMA a partir das estimativas de similaridades genéticas, expressas pelo complemento aritmético do coeficiente de Jaccard, com base em 109 bandas polimórficas de RAPD geradas nas 121 amostras de avestruz. S
“Figura 06, Cont.”
Os dados relativos à análise de variância molecular realizada para as 4 procedências das 121 amostras de avestruz, estão presentes na Tabela 06. Como se pode constatar, a porcentagem de variação genética entre procedências foi baixa e significativa (24,03%, p < 0,0001), evidenciando que grande parte da variação encontra-se dentro das populações (75,97 %).
Tabela 06. Análise de variância molecular obtida para as 4 procedências de avestruz, com base em 109 bandas polimórficas de RAPD geradas em 121 indivíduos.
FONTE DE VARIAÇÃO GL VARIÂNCIA VARIAÇÃO (%) FST
Entre Procedências 3 2,6521 24,03 0,240
Dentro de Procedências 117 8,3836 75,97
Total 120 11,0357 100
A baixa divergência constatada entre os plantéis dessas quatro procedências e o valor de FST obtidos no presente estudo indicam pouca diferenciação entre as
populações investigadas. Por outro lado, esta análise destacou forte agrupamento entre os indivíduos dentro de cada procedência, sugerindo que há tendência de estruturação genética entre eles,o que era esperado uma vez que os animais de cada plantel acasalam entre si.
Resultados semelhantes foram obtidos por Telles et al. (2003) estudando a estruturação genética por meio deste procedimento (AMOVA) em varas de queixada, tendo constatado grande variação dentro das varas. Como também, por Spritze et al. (2003) em rebanhos de bovinos da raça Crioulo Lageano onde detectaram a maior parte de variância dentro dos grupos (74,72 %).
5. CONCLUSÕES
• Os marcadores RAPD foram eficientes na caracterização da
similaridade genética;
• Pode-se deduzir que alguns indivíduos, provavelmente, têm a mesma
origem;
• Alguns indivíduos como Av91, Av58, Av1 e Av40, dentre outros, podem
ser potencialmente selecionados para programa de melhoramento genético para essa espécie;
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
1 – Brometo de etídio (10 mg/ml)
Adicionar 1 g de brometo de etídio a 100 ml de água estéril. Agitar vigorosamente em agitador magnético por várias horas, até ter certeza de que o corante esteja dissolvido. Armazenar a temperatura ambiente em recipiente de cor escura ou envolvido em folha de alumínio.
Diluição do Bometo de etídio 10mg/ml para 1 mg/µl.
Obs: o brometo de etídio é um poderoso mutagênico e moderadamente tóxico. Durante o uso deste produto ou soluções que o contenha, é recomendável o uso de luvas e máscaras. Após o uso deste produto todos os recipientes devem ser descontaminados utilizando-se métodos apropriados
2 – Bromophenol blue (Azul de bromofenol) – Tampão de carregamento (10 ml) Adicionar 0,042 g de azul de bromofenol a 7,0 ml de TAE 1x e 3,0 ml de glicerol. Estocar à temperatura ambiente.
3 – Clorofórmio : Álcool Isoamil (24:1)
Juntar 24 partes de Clorofómio a uma parte de Álcool isoamil. 4 – DNA Padrão (Solução de trabalho)
Juntar 7,0 µl do DNA ladder, 97 µl de TE pH 8,0 e 100 µl do tampão de carregamento. Armazenar a –20 ºC.
5 – dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphates) 10 mM – 500 µl
Diluir 50 µl de cada dNTP em 450 µl de água estéril para obter a solução estoque de 10 mM de cada dNTP. Armazenar a –20 ºC.
6 – dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphates) 1 mM – 1000 µl
Para obter a solução de trabalho na concentração de 1 mM dos quatro nucleotídeos juntos, deve-se juntar 100 µl da solução diluída 10 mM de cada dNTP a 600 µl de água estéril. Armazenar a –20 ºC.
A quantidade de tampão a ser usada na diluição é obtida pala fómula: (T x CFP)/(CIP x 103 ). Onde:
T= Volume do tampão a ser usado (Nº amostras x 700 + 10%) CFP= Concentração final da proteínase (50 µg/ml)
CIP= Concentração inicial da proteínase (20 mg/ml) 8 – Ribonuclease A 10 mg/ml – 1ml (Solução estoque)
Dissolver 10 mg de RNAse A em 1,0 ml de acetato de sódio 0,01 M (pH 5,2). Ajustar o pH para 7,4 adicionando Tris HCl 1 M pH 8,0 (TE). Aquecer até 100 ºC por 15 minutos. Deixar esfriar lentamente à temperatura ambiente. Dividir em alíquotas e armazenar a –20 ºC.
9 – Ribonuclease A 10 µg/ml em tampão TE – 1 ml
Juntar 10 µl de Tris HCL 1 M pH 8,0, 2 µl de EDTA 0,5 M pH 8,0, 1 µl de RNAse (10 mg/ml) e 987 µl de água estéril. Armazenar a 4 ºC.
10 – Solução de EDTA 0,5 M - pH 8,0 (1,0 litro)
Adicionar 186,1 g de dissodium ethylenediaminetetra-acetate 2H2O (EDTA) a
800 ml de água estéril. Agitar vigorosamente em agitador magnético. Mantendo a solução sobre o agitador magnético, ajustar o pH para 8,0 com a adição de NaOH (aproximadamente 20 g de NaOH peletizado). O sal dissódico EDTA não dissolve enquanto o pH da solução não se aproximar de 8,0. Dividir o volume em vazilhames de 250 ml, esterilizar por autoclavagem e armazenar a 4 ºC.
11 – Solução de NaCl 5M (1,0 litro)
Dissolver 292,2 g de NaCl em 800 ml de água estéril. Ajustar o volume para 1 litro com água estéril. Dividir o volume em vazilhames de 250 ml, esterilizar através de autoclavagem e armazenar a 4 ºC.
12 – Solução de SDS 10 % (100ml)
Juntar 10 g de SDS em 50 ml de água estéril, levar para homogeneizar na barra magnética. Completar o volume e autoclavar. Armazenar a 4 º C.
13 – Solução de Tris – HCL 1 M (1,0 litro)
Dissolver 121,1 g de Tris base em 800 ml de água estéril. Ajustar o pH para 8,0 adicionando aos poucos aproximadamente 42 ml de HCl concentrado. Aguardar a solução esfriar até a temperatura ambiente antes de fazer o ajuste final do pH. Ajustar o volume da solução para 1,0 litro com água estéril. Dividir o volume em vazilhames de 250 ml e esterilizar por autoclavagem. Armazenar à temperatura ambiente.
Ao final, se a solução apresentar-se com coloração amarelada, deve-se descartar e obter Tris de melhor qualidade.
Alguns eletrodos não medem o pH de Tris com precisão, é ideal comparar as medidas com outros eletrodos a fim de detectar aquele com maior confiabilidade.
O pH da solução de Tris é dependente da temperatura e decresce aproximadamente 0,03 unidades com pH para cada aumento de 1 ºC de temperatura. Por exemplo: Uma solução de 0,05 Molar tem valores de pH 9,5, 8,9 e 8,6 a 5 ºC, 25 ºC e 37 ºC, respectivamente.
14 – TBE (Tris bórico) 5X (1,0 litro) – (solução estoque)
Dissolver em água estéril 54 g de Tris-base (PM 121,1), 27,5 g de ácido bórico e 20 ml de EDTA 0,5 M (pH = 8,0). Completar o volume para 1000 ml e armazenar à temperatura ambiente.
15 – TBE (Tris bórico) 1X (1,0 litro) – ( solução de trabalho)
Diluir 200 ml de solução estoque 5X em 800 ml de água estéril. Armazenar à temperatura ambiente ou a 4 ºC para um período mais longo.