Resultados dos testes de CIM para as leveduras

Tabela 6 - Resultados dos testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM50/CIM90) dos antissépticos frente a leveduras isoladas de infecções intramamárias de bovinos

Antissépticos CIM50 CIM90

Ácido lático Indeterminado* Indeterminado*

Glutaraldeído Indeterminado* Indeterminado*

Triclosano 0,0015 - Hipoclorito de sódio 0,25 0,25 Amônia quaternária 0,02 0,02 Peróxido de hidrogênio 0,007 0,007 Clorexidina 0,0018 0,0018 Iodo 0,125 - Ácido peracético 0,125 -

*- Houve crescimento em todas as concentrações

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Neste estudo, verificou-se quanto aos testes de sucetibilidade de leveduras aos antissépticos que o hipoclorito de sódio a 0,25% apresentou ação inibitória sobre 90% dos isolados. O iodo a 0,125% inibiu o crescimento de 41% das cepas e o ácido peracético também na concentração de 0,125% inibiu 70% dos isolados. Não houve crescimento nas menores concentrações de amônio quaternário, peroxido de hidrogênio, clorexidina e triclosano. Por outro lado, 100% dos isolados cresceram nas maiores concentrações testadas do ácido láctico (0,5%) e de glutaraldeído (2%). Nossos resultados são corroborados por estudos prévios (PEDRINI & MARGATHO, 2003; LASSA et al., 2007; COUTINHO et al. 2012; REDÜ, 2014) que também apontaram a sensibilidade de leveduras isoladas de mastite bovina frente à clorexidina, iodo, amônio quaternário e ao ácido peracético.

Como resultados deste estudo, os antissépticos que agem ao nível de parede celular (clorexidina, triclosano e amônio quaternário) foram mais eficazes na inibição do crescimento das leveduras, o que pode ser explicado pelo fato de as mesmas possuírem uma densa parede celular. Também houve inibição de crescimento frente aos antissépticos que tem ação na desnaturação de proteínas celular (peróxido de hidrogênio e ácido peracético). De modo análogo ao verificado nos testes de CIM para as algas, estes biocidas apresentam um alto espectro de ação, o que viabiliza o uso destes antissépticos no pré-dipping e pós-dipping como medida profiláticas para a mastite ocasionada por estes agentes infecciosos.

A Tabela 6 aponta os resultados da avaliação da ação fungicida ou fungistática dos antissépticos nas concentrações referentes à CIM frente aos isolados de leveduras. De forma semelhante ao descrito anteriormente nos testes de suscetibilidade das algas aos antimicrobianos, este aponta se a ação dos antissépticos na diluição correspondente à CIM elimina ou apena inibe o crescimento do isolado. De acordo com estes testes, todas as concentrações referentes à CIM para os antissépticos tiveram ação fungicida sobre os isolados testados.

Tabela 7 - Ação fungicida, fungistática dos antissépticos perante os isolados de leveduras nas concentrações referente à CIM

Antissépticos Ação observada

Peroxido de hidrogênio Fungicida

Amônio quaternário Fungicida

Triclosano Fungicida

Clorexidina Fungicida

Iodo Fungicida

Ácido peracético Fungicida

Em se tratando de isolados de leveduras e de algas não há um ponto de corte para se determinar a concentração inibitória mínima de antibióticos ou de antissépticos, o que impede a caracterização dos mesmos como resistentes ou suscetíveis frente aos diferentes antimicrobianos avaliados.

Há um grande número de desinfetantes de tetos no mercado a serem utilizados, tendo em suas formulações o iodo, compostos aniônicos ácidos, compostos de amônio quaternário, clorexidina, ácido lático, hipoclorito de sódio, entre outros. A atividade bactericida, fungicida e algicida de vários destes biocidas foram bem documentadas na literatura (LASSA et al., 2011; COUTINHO et al., 2012; GONÇALVES et al., 2015). É decisão do produtor escolher o melhor produto que deve exibir alta atividade germicida e baixa toxicidade para o tecido animal.

Jagielski et al. (2012) relataram que variações nos valores encontrados de CIM podem estar relacionadas com a origem geográfica dos isolados, fatores ambientais, tecnológicos, protocolos terapêuticos utilizados anteriormente nos rebanhos, condições de profilaxia entre outros fatores que podem ocasionar mudanças genotípicas que refletem nos fenótipos de suscetibilidade dos isolados.

O uso indiscriminado de drogas terapêuticas é uma preocupação emergente na saúde coletiva. Estudos apontam que não somente o fenômeno da resistência dos microrganismos não se restringe apenas aos antibacterianos e que o uso continuado e indiscriminado de antissépticos, mesmo em baixas concentrações, pode estimular a resistência cruzada aos mesmos. Jutkina et al. (2018) demonstraram que baixas concentrações de triclosano e de clorexidina estimulam a transferência horizontal de genes de resistência, contribuindo para o desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos. Kampf (2018), relatou que concentrações subinibitórias de cloreto de benzalcônio foram associadas a uma maior frequência de resistência frente à ampicilina, cefotaxima e sulfametoxazol em bactérias Gram- negativas e que concentrações subinibitórias de clorexidina desencadeou aumento da resistência à ceftazidima, sulfametoxazol, imipenem, cefotaxima e tetraciclina. Estes autores relataram o aumento da resitência aos antimicroianos e a resistência cruzada aos mesmos em subconcentrações de triclosano, octenidina, hipoclorito de sódio e cloreto de didecildimetilamônio.

37

5.2 Resultados parciais da caracterização de leveduras pelo MALDI-TOF MS

Por meio da técnica de MALDI-TOF foram identificadas 100% de 37 cepas de leveduras submetidas ao teste (Tabela 8).

Tabela 8 - Resultados da identificação de leveduras isoladas de infecções intramamárias de bovinos por meio da técnica de MALDI-TOF MS

Espécie Número de isolados Frequência percentual

Candida parapsilosis 3 8,1% Candida rugosa 3 8,1% Candida pararugosa 7 18,91% Candida glabrata 1 2,70% Issatchenkia orientalis 22 59,45% Kluyveromyces marxianus 1 2,70% Fonte: Do autor (2019).

Os resultados da técnica de MALDI-TOF apontaram seis espécies diferentes, entre os 37 isolados submetidos ao teste: Candida parapsilosis, Candida rugosa, Candida pararugosa, Candida glabrata, Kluyveromyces marxianus (Candida kefyr) e Issatchenkia orientalis (Candida kruzei). Esta última foi a espécie predominante entre os isolados.

Os resultados de caracterização das espécies das leveduras obtidos no presente estudo demonstraram a predominância de algumas espécies entre os isolados de mastite bovina, em concordância com estudos prévios citados na literatura. Du et al. (2018), na China, identificaram pela técnica de espectrometria de massa as espécies C. krusei e C. parapsilosis como causadoras da mastite em bovinos. Seker (2010), na Turquia, isolou 207 espécies de Candida de casos de mastite clínica e subclínica de bovinos, dentre elas C. krusei (34,8%), C. rugosa (16,4%), C. kefyr (12,6%), C. albicans (10,1%) e C. tropicalis (9,2%). Dworecka- Kaszak et al.(2012) identificaram, na Polônia, C. parapsilosis (25 cepas) e C. krusei (15 cepas) entre 44 isolados de origem bovina estudados. Por outro lado, nossos resultados, embora sejam parciais, estão em desacordo com os resultados relatados por Mendes et al. (2018), segundo os quais Candida albicans foi a espécie predominante em isolados de mastite fúngica, representando cerca de 50% dos isolados, seguida de C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis presentes em torno de 10 a 25%, respectivamente.

Estudos apontam aumento no número de IIM ocasionadas por leveduras, o que pode estar relacionado ao uso repetitivo de antibióticos intramamários (COSTA et al., 2008;

COSTA et al., 2012) e influências sazonais que podem contribuir para o desenvolvimento dos fungos (GAUDIE et al., 2009, RANJAN et al., 2011 e ZARAOZA et al., 2011; KUMAR et al 2016).

Nossos resultados parciais apontaram a predominância Issatchenkia orientalis (Candida kruzei) como agente principal das IIM fúngicas no presente estudo. Segundo Seker (2010), as espécies de Candida são patógenos comumente isolados de infecções na glândula mamaria de bovinos, em associação com condições de baixa higiene na rotina da fazenda, o que deprime o sistema imune e facilita a colonização dos tetos por patógenos ambientais, aumentando o risco da mastite. Costa et al. (2008) e Costa et al. (2012) relataram que embora as más condições de ambiente possam estar envolvidas na ocorrência de IIM por estes agentes, a terapia intramamária repetitiva é um fator de risco também muito importante.

5.3 Dendrograma confeccionado por meio dos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS

Dois dendrogramas, baseados nos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS foram gerados pelo programa Biotyper 3.0 (Bruker) (Figuras 1 e 2).

A Figura 1 se refere ao dendrograma formado pelos 37 isolados, ilustrando a relação filogenética entre estes. Em se tratando de isolados oriundos de diferentes espécies e procedentes de locais variados, o espectro proteico é muito semelhante, com nível de distância 1,5, sugerindo que estes possuem perfil proteico muito semelhante, principalmente dentro da espécie.

O espectro de massas gerado fornece um perfil proteômico do microrganismo, sendo este perfil único para cada espécie de microrganismo, sendo possível inclusive distinguir picos específicos para os gêneros e espécies. Na análise por MALDI Biotyper, cada perfil pode ser automaticamente comparado a uma biblioteca de espectros de referência, gerando a lista dos microrganismos mais estreitamente relacionados (ANGELETTI, 2016).

39 8 17 13 1 14 21 31 15 4 2 7 10 18 27 34 24 30 32 5 33 19 28 16 36 25 29 23 37 3 6 20 12 26 22 9 11 35 0 0.5 1 1.5 PCA Dendrogram Spectra D is ta nc e Le ve l

Figura 1 - Dendrograma obtido por meio dos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS identificação de leveduras isoladas de casos de mastite bovina

Tabela 9 - Posição dos isolados de levedura no dendrograma 1, gerado com base nos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS, pelo programa Biotyper 3.0 (Bruker) Posição no

cluster

Espécie de Levedura Posição no cluster Espécie de Levedura

8 Candida parapsilosis 5 Issatchenkia orientalis

17 Candida parapsilosis 33 Issatchenkia orientalis

13 Candida parapsilosis 19 Issatchenkia orientalis

1 Candida pararugosa 28 Issatchenkia orientalis

14 Candida pararugosa 16 Issatchenkia orientalis

21 Candida pararugosa 36 Issatchenkia orientalis

31 Candida pararugosa 25 Issatchenkia orientalis

15 Candida pararugosa 29 Issatchenkia orientalis

4 Candida pararugosa 23 Issatchenkia orientalis

2 Candida glabrata 37 Issatchenkia orientalis

7 Candida rugosa 3 Issatchenkia orientalis

10 Candida parapsilosis 6 Issatchenkia orientalis

18 Candida rugosa 20 Issatchenkia orientalis

27 Candida rugosa 12 Issatchenkia orientalis

34 Kluyveromyces

marxianus

26 Issatchenkia orientalis

24 Issatchenkia orientalis 22 Issatchenkia orientalis

30 Issatchenkia orientalis 9 Issatchenkia orientalis

32 Issatchenkia orientalis 11 Issatchenkia orientalis

-- -- 35 Issatchenkia orientalis

Fonte: Do autor (2019).

Nota-se no dendrograma 1 o agrupamento dos isolados em dois grandes clusteres. O primeiro (em vermelho) congrega levedura de espécies diferentes. As três primeiras posições do dendograma 1 correspondem à uma única espécie: Candida parapsilosis. Da quarta posição até a nona foram alocados os isolados de Candida pararugosa e, em seguida, Candida glabrata, Candida rugosa, Candida parapsilosis, e novamente Candida rugosa. No final deste cluster foi alocado um único isolado de Kluyveromyces marxianus. O segundo grande cluster (em azul) congregou apenas isolados de Issatchenkia orientalis (Candida kruzei), demonstrando a similaridade proteica entre estes isolados.

A Figura 2 também apresenta um dendrograma obtido a partir do perfil proteico de isolados oriundos de um mesmo rebanho do sul de Minas Gerais no qual houve um surto de mastite bovina por leveduras. Nota-se, em conformidade com o dendrograma da Figura 1, grande similaridade protéica entre isolados, com nível de distância de 1,4. Entretanto, esperava-se neste caso, maior nível de similaridade em função da origem comum dos isolados. O dendrograma foi dividido em dois grandes clusteres. No primeiro cluster (em

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vermelho), onde foram congregados 5 isolados: em primeira e segunda posição Candida pararugosa, em seguida Candida rugosa e Kluyveromyces marxianus e por último um isolado de Issatchenkia orientalis que se destaca dos dois clusters formados, supondo um perfil proteico diferente até mesmo dos isolados de sua espécie. O segundo grande cluster é formado apenas por isolados de Issatchenkia orientalis, constituindo um cluster que denota perfis protéicos muito semelhantes entre os isolados deste cluster.

A análise dos dendrogramas 1 e 2, aponta grande similaridade nos perfis protéicos dos isolados de levedura estudados, ainda que oriundos de espécies diferentes que diferem também espacial e temporalmente em termos de origem.

Figura 2 - Dendrograma obtido por meio dos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS para de leveduras isoladas de um surto de mastite bovina em Minas Gerais

2 9 5 12 1 3 7 13 4 14 6 8 10 11 15 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 PCA Dendrogram Spectra D is ta n c e L e v e l

Tabela 10 - Posição dos isolados de levedura no dendrograma 2, gerado com base nos perfis protéicos obtidos no MALDI-TOF MS, pelo programa Biotyper 3.0 (Bruker) Posição no cluster Espécie de Levedura

2 Candida pararugosa 9 Candida pararugosa 5 Candida rugosa 12 Kluyveromyces marxianus 1 Issatchenkia orientalis 3 Issatchenkia orientalis 7 Issatchenkia orientalis 13 Issatchenkia orientalis 4 Issatchenkia orientalis 14 Issatchenkia orientalis 6 Issatchenkia orientalis 8 Issatchenkia orientalis 10 Issatchenkia orientalis 11 Issatchenkia orientalis 15 Issatchenkia orientalis Fonte: Do autor (2019).

Neste estudo foi possível fazer uma identificação precisa dos controles dentro da biblioteca, constatando a confiabilidade da técnica na identificação de espécies de leveduras. Vários estudos já foram realizados comprovando a eficácia do MALDI-TOF na identificação de uma grande variedade de espécies de microrganismos (BARREIRO et al., 2017; NONNEMANN et al., 2019).

Este estudo possibilitou a identificação de espécies de isolados de leveduras pela técnica de MALDI-TOF MS e a avaliação dos perfis de suscetibilidade de algas e leveduras a antimicrobianos e antissépticos in vitro, fornecendo conhecimentos que poderão ser úteis no controle e na prevenção das infecções intramamárias ocasionadas por estes agentes.

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6 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos in vitro apontaram resistência das algas aos antibacterianos, exceção para gentamicina, amicacina e polimixina B, o que sugere potencial de uso destes medicamentos no tratamento da mastite ocasionada por estes agentes. Testes complementares deverão ser posteriormente realizados para a avaliar a efetividade destes antibióticos in vivo.

Os isolados de algas apresentaram suscetibilidade para a maioria dos antissépticos testados, exceção para glutaraldeído. O antisséptico ácido láctico incrementou o crescimento das algas, sugerindo que estas possam utilizá-lo como substrato para o crescimento.

Todos os antissépticos testados apresentaram ação inibitória em baixas concentrações contra as leveduras, sugerindo seu possível uso na rotina de fazendas leiteiras como pré e pós- dipping, exceção para o ácido láctico e glutaraldeido que demonstraram baixa efetividade.

A espectrometria de massa, MALDI-TOF MS, permitiu identificar os isolados de leveduras, apontando a predominância da Issatchenkia orientalis anteriormente denominada Candida krusei entre os isolados testados. A análise dos dendrogramas obtidos por meio do programa Biotyper 3.0 (Bruker) apontou grande similaridade nos perfis protéicos dos isolados estudados, indicando similaridade filogenética entre os mesmos.

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