A análise do comportamento das células das linhagens ATCC 23270 e LR, sob os efeitos do cloreto de sódio, mostraram que as duas linhagens atingiram 100% de oxidação de Fe2+ na condição controle (ausência de sal) e na concentração de 100 mM
de NaCl (5,84 g/L). Na ausência do sal a oxidação completa do Fe2+ ocorreu em 24 h
e na concentração de 100 mM de NaCl em 48 h, o dobro do tempo. Após um período de 108 h (décimo e último ponto de leitura), nenhuma das linhagens atingiu 100% de oxidação de Fe2+ na presença de 200 mM (11,68 g/L) e 300 mM (17,52 g/L) de NaCl. A linhagem ATCC 23270 apresentou um percentual de oxidação de Fe2+ maior do que o da LR nestas duas condições, sendo que esta atingiu 87% de oxidação de Fe2+ na presença de 200 mM de NaCl, enquanto a LR atingiu 81,5%, já na presença de 300 mM de NaCl, a linhagem ATCC 23270 atingiu 13,5% e a LR atingiu 6% (figura 1 e 2).
Figura 1. Curva de oxidação de Fe2+ por A. ferrooxidans ATCC 23270, em diferentes concentrações de NaCl (100 mM, 200 mM e 300 mM).
Oxidação de Fe2+ (%)
Figura 2. Curva de oxidação de Fe2+ por A. ferrooxidans LR, em diferentes
concentrações de NaCl (100 mM, 200 mM e 300 mM).
Estes resultados corroboram os trabalhos que mostram que a maioria dos micro-organismos acidófilos utilizados na biolixiviação são sensíveis a altas concentrações de íon cloreto (Shiers et al., 2005; Gahan, 2010; Xiong & Guo, 2011; Zammit et al., 2012). Zammit et al. (2012) mostraram que em A. ferrooxidans DSM 14882 (ATCC 23270) cultivada em meio de sais minerais (MSM), o crescimento e a oxidação de Fe2+ são inibidos na presença de ≥ 7 g/L de NaCl. Gahan (2010) estudou o efeito do cloreto em cultura mista de mesófilos oxidantes de Fe2+ dominada por Leptospirillum ferriphilum e contendo também Sulfobacillus sp., A. ferrooxidans sp. e Acidithiobacillus thiooxidans. Os resultados mostraram que o aumento gradual da concentração de íon cloreto foi concomitante com o aumento do tempo necessário para crescimento da cultura. Na ausência de íon cloreto, esta fase durou cerca de 25 h, e na presença de 11 g/L cerca de 10 dias. Já na concentração de 12 g/L de NaCl não foi observado o crescimento da cultura após duas semanas.
Com base nos resultados obtidos para as linhagens LR e ATCC, é possível reforçar que a oxidação completa de Fe2+ por A. ferrooxidans, na presença de NaCl, ocorre em concentrações inferiores a 7 g/L. Desta forma, a concentração de 5,84 g/L (100 mM) de NaCl foi escolhida para os experimentos de análise de expressão de genes por PCR em tempo real. Embora a linhagem LR tenha se mostrado um pouco
Oxidação de Fe2+ (%)
mais sensível que a ATCC 23270 na presença de 200 e 300 mM de NaCl, esta foi escolhida por ser uma linhagem isolada no Brasil e que apresenta boa capacidade de biolixiviação.
Genômica Comparativa
Genes envolvidos no estresse osmótico causado por NaCl
A partir do levantamento bibliográfico, foram selecionadas 40 proteínas candidatas relacionadas à tolerância ao NaCl, que serviram como base para a construção de modelos HMM. O número de sequências utilizadas para a criação dos modelos variou de proteína para proteína. Dos 40 modelos que foram construídos, 27 identificaram proteínas semelhantes codificadas pelo genoma de A. ferrooxidans ATCC 23270 (NCBI). Dentre estas, seis foram escolhidas, para a análise de expressão de seus genes, de acordo com suas funções e seu melhor e-value(tabela 3). O e-value indica o número de sequências aleatórias (falsos positivos) que esperamos que sejam identificadas dado o tamanho do banco de dados procurado.Assim como um modelo foi capaz de identificar mais de uma proteína, em outros casos, modelos distintos puderam identificar a mesma proteína. Como exemplo temos a proteína AFE_2862 que foi identificada tanto pelo modelo HMM da proteína OpuAA, como o da ProV, ambas proteínas ABC transportadoras dependentes de ATP.
Tabela 3. Proteínas identificadas no genoma de A. ferrooxidans ATCC 23270 a partir
de modelos HMM construídos com sequências de proteínas ortólogas.
Proteína Modelo
Locus
(NCBI) Função Proteína e-value
Função na tolerância ao NaCl AqpZ AFE_0154 família de proteína de canal de membrana 1.4E-28 formação de poros na membrana plasmática para transporte de água e pequenos solutos neutros
BetA AFE_1856 colina
desidrogenase 3.6E-11
síntese de glicina betaína a partir de colina KdpA AFE_2232 translocação de potássio ATPase, subunidade A 4.3E-225 captação de K+ para o dentro da célula como resposta ao estresse
osmótico
NhaA AFE_2205 antiportador de
Na+/H+ 1.5E-163
responsável por processos de homeostase
de Na+ e pH
OpuAA/ProV AFE_2862 ABC transportador
dependente de ATP 1.8E-60
ABC transportador do sistema de obtenção de
glicina betaína YceI AFE_0461 proteína YceI 9.8E-47 função desconhecida
Dentre os modelos HMM disponíveis no banco de famílias de proteínas Pfam, 34 modelos foram utilizados e tiveram as proteínas identificadasno genoma de A. ferrooxidans. Foram escolhidas quatro proteínas, para a análise da expressão dos seus genes, também de acordo com suas funções e melhor e-value (tabela 4).
Tabela 4. Proteínas identificadas no genoma de A. ferrooxidans ATCC 23270 a partir
de modelos HMM disponíveis no banco de famílias de proteínas Pfam.
Pfam Locus
(NCBI)
Função
Proteína ID Pfam e-value
Função na tolerância ao NaCl
AA_permease_2 AFE_1782 aminoácido
permease PF13520.1 4.7E-41 permease de membrana envolvida no transporte de aminoácidos para célula BPD_transp_1 AFE_2991 permease ABC transportadora de peptídeos PF00528.17 2.0E-32 permease de membrana envolvida no transporte de peptídeos para célula Glu_syn_central AFE_0730 glutamato sintase, subunidade maior PF04898.9 1.5E-104 precursor de outros aminoácidos
OsmC AFE_3241 OsmC/Ohr família de proteína
PF02566.14 8.2E-18 proteína induzida osmoticamente
No geral, foram identificadas proteínas com diversas funções relacionadas à resposta ao estresse osmótico causado por NaCl, como: proteínas de captação, transporte e síntese de solutos compatíveis; proteínas responsáveis pela captação e acúmulo de K+; proteínas de membrana para o transporte de moléculas; além de proteínas com funções ainda desconhecidas.
Embora as funções destas proteínas, em resposta ao estresse osmótico causado por NaCl, sejam conhecidas em outras espécies de bactérias,é de extrema importância investigar se em A. ferrooxidans estas proteínas atuam da mesma forma, ou seja, possuem a mesma função. Já os estudos de proteínas com funções ainda desconhecidas, abrem novos caminhos para a identificação e caracterização destas.A análise da expressão dos genes, que codificam estas proteínas, é uma forma de verificar se eles apresentam expressão diferencial em resposta ao estresse osmótico
causado por NaCl. Desta forma, foram escolhidos 10 genes em A. ferrooxidanspara experimentos de análise da expressão por PCR em tempo real.
Análise da expressão dos genes envolvidos na resposta ao estresse osmóticocausado por NaCl em A. ferrooxidans
A expressão relativa foi baseada na comparação dos genes expressos na presença de 100 mM de NaClem relação à condição controle (ausência de NaCl) e as diferenças foram consideradas significativas quando p ≤ 0,05 e a expressão relativa ≥ 1,5.Dos 10 genes analisados, três apresentaram expressão relativa > 2,5 e outros cinco apresentaram entre 1,5 e 2,5. Dois genes apresentaram expressão relativa menor que 1,5(tabela 5).
Tabela 5. Expressão relativa dos genes envolvidos na tolerância ao NaCl e
significância das diferenças observadas (p ≤ 0,05).
Locus (NCBI)
Proteína ou Pfam usado como modelo
Expressão Relativa p value ajustado Expressão na presença de NaCl
AFE_0461 YceI 2,68 0,00073 Up-regulated
AFE_1782 AA_permease_2 (Pfam) 2,58 0,01796 Up-regulated
AFE_1856 BetA 2,54 0,00231 Up-regulated
AFE_3241 OsmC (Pfam) 2,38 0,00298 Up-regulated
AFE_2991 BPD_transp_1 (Pfam) 1,85 0,00037 Up-regulated
AFE_2205 NhaA 1,83 0,00267 Up-regulated
AFE_2232 KdpA 1,66 0,02372 Up-regulated
AFE_0154 AqpZ 1,64 0,00306 Up-regulated
AFE_2862 OpuAA/ProV 1,28 0,03960 Inalterado
AFE_0730 Glu_syn_central (Pfam) 1,19 0,04486 Inalterado
Nota. Valor p obtido com o teste t de Studente ajustado com controle de falsos positivos (FDR).
As prováveis funções dos genes que apresentaram aumento na expressão relativa e os possíveis mecanismos nos quais estes participam, na resposta ao estresse osmótico causado por NaCl, são discutidos a seguir.
Gene AFE_0461 – Proteína hipotética
O gene AFE_0461 foi o que apresentou maior expressão relativa na presença de NaCl. Ele foi encontrado no genoma de A. ferrooxidans a partir de buscas utilizando o modelo HMM da proteína YceI. Na anotação do genoma, esta proteína está classificada como hipotética, mas a análise da sequência de aminoácidos confirma que ela possui um domínio conservado presente nas proteínas da família YceI. As proteínas YceI são periplasmáticas putativas que ainda não possuem função definida, mas acredita-se que elas desempenham funções variadas em diferentes espécies de micro-organismos. Zammit et al. (2012) estudaram o efeito do íon cloreto em Acidimicrobium ferrooxidans e Acidithiobacillus caldus e concluíram que a expressão da proteína YceI nestes micro-organismos está envolvida no estresse osmótico causado por NaCl. Em E. coli, o estudo da indução de proteínas dependente de pH, mostrou que a proteína Ycel é induzida em pH básico (Stancik et al., 2002), porém, a relação da entre a indução da proteína por pH básico ainda não foi estabelecida.
A proteína TT1927b de Thermus thermophillus HB8 possui estrutura em forma de barril beta. O estudo da estrutura cristalina desta proteína sugere que esta é uma proteína pertencente à família YceI que se liga ao poliprenil pirofosfato, precursor da síntese da cadeia lateral isoprenóide das quinonas isoprenóides (Handa, et al., 2005). As quinonas isoprenóides estão presentes em todos os organismos, procariotos e eucariotos, e são componentes lipossolúveis essenciais da cadeia de transporte de elétrons ligada à membrana celular (Søballe & Poole, 2000; Clarke et al., 2014). São formadas por um núcleo quinona hidrofílico ligado à uma cadeia lateral isoprenóide hidrofóbica (Vincent et al., 2010), sendo que a cadeia lateral pode variar de comprimento dependendo da espécie (Collins e Jones, 1981; Handa et al., 2005). Em bactérias, as quinonas podem ser divididas em dois grupos: (i) ubiquinonas (UQ-n); (ii) menaquinonas (MK-n) e dimetilmenaquinonas (DMK-n); onde –n se refere ao número de unidades isoprenóides da cadeia lateral (Søballe & Poole, 2000).O estudo da proteína Sde-1182 de Saccharophagus degradans,mostrou que esta também possui estrutura em forma de barril beta, com um domínio de ligação (domínio X158) para duas moléculas isoprenóides relacionadas, ubiquinona e octaprenil pirofosfato (OPP) (Vincent et al., 2010).
A análise do genoma de diferentes micro-organismos revelou que, muitas vezes, o gene que codifica o citocromo b561, uma proteína de membrana transportadora de elétrons, é adjacente ao gene yceI, principalmente em espécies de bactérias Gram-negativas (Handa et al., 2005; Vincent et al., 2010). Isso ocorre em Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Yersiniapestis, Mesorhizobium loti e Xylella fastidiosa, sugerindo que a proteína YceI pode estar envolvida no sistema de transporte de elétrons pela ligação de moléculas isoprenóides (Handa et al., 2005). Em Caulobacter crescentus, bactéria Gram-negativa, a proteína YceI é fundida com o citocromo b561 (Vincent, 2010). Assim como as quinonas, os citocromos também estão presentes em todos os organismos e são componentes essenciais da cadeia de transporte de elétrons. Os citocromos são proteínas que contêm grupos prostéticos hemes, que alternam seu estado de oxidação Fe2+ e Fe3+, durante o transporte de elétrons, e são capazes de absorver altas intensidades de luz. São divididos em três grupos (a, b e c), que são distinguidos por seus espectros de absorção de luz.
Em A. ferrooxidans, o citocromo b561 é codificado pelo gene AFE_2328, mas, embora este gene não seja adjacente ao gene AFE_0461, que codifica a proteína YceI, a análise da interação das proteínas, realizada no banco de dados STRING,
mostrou que existe uma possível interação entre o citocromo b561 e a proteína YceI (score 0.68), porém, esta relação ainda não foi estabelecida (figura 3).
Figura 3. Rede de interação proteína-proteína, em A. ferrooxidans,estabelecida pelo
STRING, mostrando interação entre a proteína YceI (AFE_0461) e as proteínas: proteína de ligação repressora de triptofano WrbA (AFE_0460); D-alanil-D-alanina
Vizinho s
dipeptidase (AFE_0462); DNA-formamidopirimidina glicosilase (AFE_0463); proteína hipotética (AFE_0464); citocromo b561 (AFE_2328).
A rede de interação de proteínas, estabelecida pelo STRING, mostra que as proteínas AFE_0460 (proteína de ligação repressora de triptofano WrbA), AFE_0462 (D-alanil-D-alanina dipeptidase), AFE_0463 (DNA-formamidopirimidina glicosilase) e AFE_0464 (proteína hipotética), apresentam interação com a proteína YceI como proteínas vizinhas, ou seja, proteínas que são codificadas pelos genes adjacentes ao gene AFE_0461, que codifica a proteína YceI. Já a proteína AFE_2328 (citocromo b561) apresenta interaçãode co-expressão com a YceI. De acordo com o STRING, a interação de co-expressão, entre a YceI e o citocromo b561 em A. ferrooxidans, foi estabelecida a partir da análise da interação de proteínas homólogas co-expressas em E. coli K12 MG1655 (score 0.32): YceI (proteína secretada) e YceJ (citocromo b561 putativo). Ainda não foram publicados estudos que comprovem se a co-expressão da proteína YceI e o citocromo b561 realmente ocorre em A. ferrooxidans, sendo então, esta análise estabelecida pelo STRING, uma predição de que em A. ferrooxidans também ocorra esta interação.
Para uma análise mais aprofundada sobre a possível função que a proteína YceI desempenha em A. ferrooxidans e a relação da indução desta na presença do NaCl, foi realizada a predição da estrutura terciária da proteína codificada pelo gene AFE_0461. A partir do alinhamento da sequência alvo, proteína YceI de A. ferrooxidans, com as sequências modelos, selecionadas pelo servidor I-TASSER a partir do BLAST, foram gerados cinco modelos tridimensionais das estruturas proteicas. O modelo 1 foi o que apresentou os melhores resultados (C-score 1,36, TM-score 0,55 e RMSD 8,5 Å) sendo este considerado o melhor modelo predito da proteína YceI de A. ferrooxidans. Este modelo foi baseado na estrutura da cadeia A da proteína 1Y0G (1Y0GA) de E. coli, que é formada por quatro cadeias (A, B, C e D). O trabalho sobre a estrutura da 1Y0G ainda não foi publicado,mas no banco PDB ela está classificada como uma proteína periplasmática em formato de barril beta que possui como ligante o 2-octaprenil 6-hidroxifenol (8PP).
O modelo 1 gerado pelo I-TASSER foi denominado de YceI_Afe e possui estrutura em forma de barril beta, sendo esta uma única cadeia constituída por 213 resíduosde aminoácidos, sendo identificado como sítio ativo os resíduos: His48, Val51, Phe53, Ile55, His57, Phe67, Thr75, Phe76, Asp84, Arg85, Val86, Ile88, Ile90,
Leu106, Ile120, Phe122, Phe152, Phe176, Ile182, Arg184, Ile193, Val207 e Val210. Além da predição da estrutura terciária e do sítio ativo, foi possível simular a presença do ligante complexado à proteína, identificado também como 2-octaprenil 6- hidroxifenol (8PP) (figura 4).
Figura 4. (A e B) Modelos preditos da proteína YceI_Afe, de A. ferrooxidans,
mostrando a estrutura terciária em forma de barril beta (dourado), complexada ao ligante 2-octaprenil 6-hidroxifenol (8PP) (azul).
O 8PP é um precursor da biossíntese da ubiquinona (UQ-8), coenzima carreadora da cadeia de transporte de elétrons na respiração aeróbia, que também atua contra o estresse oxidativo como antioxidante na quebra de cadeias de radicais livres, garantindo o equilíbrio intracelular (Clarke et al., 2014). Na biossíntese da ubiquinona, o 2-octaprenil 6-hidroxifenol é convertido em 2-poliprenil 6-metoxifenol pela enzima 2-poliprenil-6-hidroxifenil metilase. A UQ-8 é sintetizada via corismato e envolve a participação de várias enzimas. Como exemplo, uma análise no banco de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) mostra que na via da biossíntese de ubiquinona em E. coli, há a participação de oito enzimas, sendo estas: UbiC, UbiA, UbiD, UbiI, UbiG, UbiH, UbiE, UbiF. Uma busca realizada no genoma de A. ferrooxidans mostrou a presença de genes que codificam estas oito enzimas,
responsáveis pela biossíntese de ubiquinona via corismato, sendo estas:UbiC (AFE_0598: corismato liase); UbiA (AFE_0592: 4-hidroxibenzoato poliprenil transferase); UbiD (AFE_2383: 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato de carboxi-liase); UbiB (AFE_0305: 2-poliprenil fenol 6-hidroxilase); UbiG (AFE_1825: 3- demetilubiquinona-9 3-metiltransferase); UbiH-1 (AFE_2389: 2-octaprenil-6- metoxifenol hidroxilase) e UbiH-2 (AFE_2388: 2-octaprenil-6-metoxifenol hidroxilase); UbiE (AFE_0289: ubiquinona/menaquinona metilitransferase) e UbiF (AFE_3239: demetoxiubiquinona hidroxilase).
A relação entre a síntese da ubiquinona e a adaptação ao estresse osmótico causado pelo NaCl em bactérias, começou a ser estabelecida recentemente a partir do trabalho realizado por Sévin & Sauer (2014). Nesse estudo, foi analisada a resposta metabólica global de E. coli submetida ao estresse osmótico causado pelo NaCl, por espectrometria de massa, com o intuito de verificar quais adaptações metabólicas ocorrem nesse tipo de estresse. Após a observação de um aumento substancial da maioria dos intermediários da via da biossíntese da ubiquinona, foram realizados experimentos in vitro, utilizando lipossomos artificiais livres de proteínas. Estes experimentos puderam confirmar que a estabilização da membrana celular é mediada por UQ-8, independente do seu papel na respiração ou na sua atuação como antioxidante, sendo este um dos principais mecanismos de osmoproteção em E. coli.
O trabalho realizado por Sévin & Sauer (2014) e os estudos das estruturas cristalinas de proteínas da família YceI em diferentes espécies, corroboram com os resultados obtidos no presente trabalho. A análise da expressão do gene AFE_0461 em A. ferrooxidans, sob estresse osmótico causado por NaCl, bem como a predição da estrutura terciária da proteína codificada por este gene, abrem uma nova visão para a interpretação de uma possível relação entre a função da proteína YceI e o papel que esta pode desempenhar na resposta ao estresse osmótico. A partir da predição da estrutura da proteína YceI_Afe, foi possível identificar um domínio de ligação para o 2-octaprenil 6-hidroxifenol (8PP), um dos precursores da síntese de ubiquinona. Desta forma, é possível sugerir que o aumento da expressão do gene AFE_0461 em A. ferrooxidans, que codifica a proteína YceI_Afe, está relacionado a um mecanismo de resposta ao estresse osmóticopor meio da biossíntese de ubiquinona, que auxilia na estabilização da membrana celular.
Uma análise filogenética utilizando sequências de aminoácidos da proteína YceI, de diversas espécies de bactérias, e sequências de nucleotídeos do gene
ribossomal 16S (figura 5) mostrou uma baixa convergência filogenética entre as árvores. A falta de convergência filogenética indica a presença de sequências da proteína YceI semelhantes em espécies de grupos distintos, mas que habitam ambientes semelhantes. A árvore da proteína YceI sugere que as proteínas YceI das espécies do gênero Acidithiobacillus, possuem características semelhantes à espécies do gênero Thiomonas, que pertencem à classe Betaproteobacteria e do Filo Nitrospirae, como a espécie Leptospirillum ferriphilum. Assim como A. ferrooxidans, as espécies Leptospirillum ferriphilum e Thiomonas intermedia são espécies acidófilas oxidantes de ferro e compostos de enxofre, respectivamente. Vale ressaltar que a espécie L. ferriphilum também é utilizada em processos de biolixiviação.
Figura 5. (A) Relações filogenéticas baseadas nas sequências de aminoácidos de
proteínas da família YceI. (B) Relações filogenéticas baseadas nas sequências de nucleotídeos de rDNA 16S. Valores de bootstrap obtidos com 1000 repetições. T: linhagem tipo.
(A)
No geral, a árvore filogenética das sequências de aminoácidos das proteínas YceI apresentou agrupamento das sequências de Acidithiobacilluscom a maioria de espécies pertencentes à classe Gammaproteobacteria, com exceção das espécies Azospirillum lipoferum e Caenispirillum salinarum (classe Alphaproteobacteria), Thiomonas intermedia (classe Betaproteobacteria) e L. ferriphilum (filo Nitrospirae). Também foi possível notar que a busca por sequências semelhantes às de A. ferroxidans utilizando a ferramenta BLASTp resultou em sequências provenientes de várias espécies que habitam ambientes com altas concentrações de sal, como no caso as espécies Idiomarina xiamenensis (Wang et al., 2011), Marinobacterium rhizophilum (Kim et al., 2008), Caenispirillum salinarum (Ritikaet al., 2012), Oceanospirillum beijerinckii (Satomi et al., 2002), Marinomonas posidonica (Lucas- Elío et al., 2011) e Halothiobacillus neapolitanus (Kelly & Wood, 2000). A espécie Halothiobacillus neapolitanus, além de halofílica, obtém energia a partir de compostos reduzidos de enxofre (Kelly & Wood, 2000). A sequência de aminoácidos das proteínas YceI do gênero Acidithiobacillus, se agruparam com a sequência da proteína YceI da espécie H. neapolitanus. Isto sugere possíveis eventos de transferência horizontal do gene de yceI entre espécies de bactérias halofílicas e espécies do gênero Acidithiobacillus, como a espécie H. neapolitanus.
Gene AFE_1782 – Aminoácido permease
As aminoácidos permeases são proteínas de membrana responsáveis pelo transporte de aminoácidos para dentro da célula. Os aminoácidos são utilizados como nutrientes (fonte de carbono) pelas bactérias (Valdés et al., 2008) mas, sob condições de estresse osmótico, muitas bactérias utilizam a estratégia de acumular aminoácidos e seus derivados (como prolina, glicina betaína e ectoína) no citoplasma, promovendo o equilíbrio osmótico (Oren, 2002).
Foram encontrados cinco genes que codificam aminoácidos permeases no genoma de A. ferrooxidans e, dentre eles, o gene AFE_1782 apresentou o melhor e- value, sendoselecionado para análise de expressão.O estudo da sequência de aminoácidos codificada por este gene mostrou que ela possui o domínio da proteína PotE. Esta proteína é um transportador de poliaminas que em pH neutro desempenha a função de importador de putrescina dependente de prótons, já em pH ácido, é um antiportador ornitina-putrescina (Figura 6) (Tomitori et al., 2012; Kurihara & Suzuki, 2015). A ornitina é um aminoácido incomum precursor da síntese de putrescina a
partir de arginina. A putrescina, espermidina, espermina e cadaverina são poliaminas celulares amplamente distribuídas na natureza e são essenciais para o crescimento e multiplicação celular em organismos procarióticos e eucarióticos (Shah & Swiatlo,