Para descrever a casuística, fizemos uma análise descritiva caracterizando os pacientes por grupos – sexo, sazonalidade, idade, sorogrupo por ano, suspeitas clínicas à esclarecer e os municípios.
De acordo com o levantamento realizado de amostras de óbitos de pacientes com suspeitas de meningite ou meningococcemia, que entraram no Núcleo de Anatomia Patológica do IAL, no período de 2009 a 2015, foram encontrados 320 pacientes, dos quais selecionamos casos de meningite bacteriana e viral.
Na figura 7 temos a incidência da mortalidade por sexo entre a meningite bacteriana e a meningite viral.
Figura 7 – Incidência por sexo da meningite bacteriana (esquerda) e meningite viral (direita), relacionado ao período de 2009 a 2015, dos casos levantados no NAP-IAL.
Podemos observar no gráfico a esquerda que dos casos selecionados de meningite bacteriana, 58% eram do sexo masculino, enquanto que 42% eram do sexo feminino, no período de 2010 a 2015. Em 2009 tivemos um caso que não foi realizado o exame imuno-histoquímico por não haver anticorpo padronizado para a técnica. No gráfico à direita, temos a incidência de 50% do sexo masculino e 50% do sexo feminino, nos casos de meningite viral. Há uma variação muito pequena da incidência entre os sexos e entre as meningites.
De acordo com a sazonalidade, podemos observar a diferença entre a meningite bacteriana e a meningite viral na figura 8.
Figura 8 – Incidência por sazonalidade da meningite bacteriana (esquerda) e meningite viral (direita) relacionado ao período de 2009 a 2015, dos casos levantados no NAP-IAL.
Com relação à meningite bacteriana, a prevalência da doença ocorre no segundo e terceiro trimestres, com 34,85%, equivalendo às estações outono e inverno do ano. De acordo com a literatura, a meningite bacteriana ocorre durante todo o ano, principalmente no inverno, o que equipara aos nossos resultados (ROSENSTEIN et al., 2001). Já na meningite viral, observamos que a prevalência ocorre no primeiro trimestre, com 41%, seguido do terceiro trimestre, com 27%. Como a maioria dos casos eram de dengue e influenza A e H1N1, isto fundamenta a prevalência dos nossos resultados serem nas estações verão e inverno respectivamente.
Além desses parâmetros, correlacionamos as idades dos pacientes para visualizar a distribuição pelas meningites bacteriana e viral (figura 9 e 10).
Figura 9 – Distribuição por faixa etária da meningite bacteriana relacionado ao período de 2009 a 2015, dos casos levantados no NAP-IAL.
Figura 10 – Distribuição por faixa etária da meningite viral relacionado ao período de 2009 a 2015, dos casos levantados no NAP-IAL.
Referente aos gráficos acima, podemos ver na figura 9, a maior incidência da meningite bacteriana está na faixa etária de 5 a 17 anos, com 24% dos casos, seguido da faixa etária de 18 a 34 anos, com 22% dos casos. As taxas estão baixas na infância, porém aumentam na adolescência e nos adultos jovens. De acordo com a literatura, os
casos vêm aumentando desde a década de 90 entre os adolescentes, com idades entre 16 e 25 anos (ROSENSTEINS et al., 2001). Com relação à figura 10, a faixa etária de 35 a 49 anos é a mais afetada na meningite viral, com 32% dos casos, seguido da faixa etária de 18 a 34 anos, com 28%.
De acordo com os sorogrupos (figura 11), no período de 2009 a 2015 dos dados levantados no NAP-IAL, a prevalência por ano é do sorogrupo C, sendo este o predominante no Brasil, quando comparado com dados epidemiológicos do país. O sorogrupo W vem emergindo nos últimos anos no Brasil, enquanto que o sorogrupo B vem diminuindo a sua incidência no país.
Figura 11 – Prevalência dos sorogrupos nos últimos 6 anos dos dados levantados no NAP-IAL.
Para a realização do levantamento de dados, amostras de óbitos de pacientes com suspeitas clínicas de meningite ou meningococcemia, que entraram no NAP-IAL, no período de 2009 a 2015, foram analisadas. Porém, de acordo com a figura 12, outras suspeitas confrontavam, como influenza A, H1N1, dengue, febre maculosa, entre outras.
Figura 12 – Gráfico das suspeitas que confrontavam com a meningite ou a meningococcemia dos 320 casos levantados no NAP-IAL, no período de 2009 a 2015.
As amostras que o NAP-IAL recebem não são apenas da cidade de São Paulo. Outras cidades do Estado de São Paulo também enviam as suas amostras, uma vez que o Instituto Adolfo Lutz é uma instituição de referência nacional e regional. Dos 320 casos, 286 casos vieram do Estado de São Paulo, 18 de Goiás, 8 de Pernambuco, 3 do Espírito Santo, e os Estados de Tocantins, Santa Catarina, Paraná, Piauí e Mato Grosso há 1 caso de cada estado. A figura 13 mostra os municípios que o NAP-IAL recebe amostras.
Figura 13 – Gráfico representativo dos diversos municípios do Estado de São Paulo e de outros Estados que o NAP-IAL recebe amostras.
O Laboratório de IHQ, buscando toda a eficiência, testou dois anticorpos monoclonais, sendo desenvolvidos para meningococos no Laboratório de Anticorpos Monoclonais Antígenos e Adjuvantes. Os dois anticorpos monoclonais foram aplicados a amostras de cérebro de casos de meningite meningocócica, meningite causada por outras bactérias, meningite de etiologia viral e em tecido cerebral sem alterações patológicas.
No presente estudo, todos os blocos e/ou lâminas selecionados no NAP-IAL foram registrados em planilhas, cada caso sendo posteriormente preparadas lâminas com novos cortes histológicos, corados por hematoxilina e eosina e examinados pelos médicos patologistas. Isto é extremamente importante para a garantia da qualidade do processo como um todo. A partir da análise histopatológica, as corretas indicações e seleção do painel de anticorpos pelo patologista, o protocolo de reações para aquele
anticorpo e a interpretação das lâminas depois da reação de IHQ é imprescindível para o rastreamento do caso e liberação do laudo, não restando dúvidas sobre a confiabilidade do processo todo.
Outras metodologias podem auxiliar os patologistas na análise dos casos, como por exemplo o PCR. A metodologia de real-time PCR (RT-PCR) foi introduzida na rotina do Instituto Adolfo Lutz, no Centro de Imunologia, após a sua validação no ano de 2011, para bactérias causadoras de meningite: Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae e Haemophilus influenzae. Neste trabalho de validação, foi demonstrada
uma alta sensibilidade e especificidade quando feito o PCR em líquido cefalorraquidiano e comparado com culturas de bactérias que o resultado foi negativo. A alta sensibilidade foi em torno de 90% descrito para as bactérias N. meningitidis e S.
pneumoniae. Com isso, o RT-PCR para o diagnóstico de bactérias meningocócicas foi
incorporado à saúde pública com sucesso e está sendo utilizado como comparativo dos resultados das reações de IHQ (SACCHI, 2011).
Para a futura utilização, foi realizada nos 10 casos selecionados do Núcleo de Anatomia Patológica, uma reação de IHQ, de acordo com o protocolo pré-estabelecido, utilizando os dois anticorpos monoclonais, o NM e o NL, e o anticorpo policlonal contra N. meningitidis. O resultado desta reação está contemplado na tabela 2.
Tabela 2 - Avaliação comparativa da metodologia de PCR, anticorpos monoclonais NL e NM, e anticorpos policlonais para os diferentes patógenos analisados, em amostras de cérebro de óbitos do Núcleo de Anatomia Patológica do Instituto Adolfo Lutz.
n.IHQ PCR
NM 1:5
NL
1:2000 Obs.
1 E43.929 Men C + + IHQ Men poly +
2 E44.423 Men B + + IHQ Men poly +
3 E44.858 Men C + + IHQ Men poly +
4 E45.462 Men C + + IHQ Men poly +
5 E45.808 Men C;
Rickettsia
neg neg IHQ Men poly neg;
IHQ Rickettsia sp poly +
6 E44.430 Strepto neg neg IHQ Men poly neg
7 E44.436 Strepto neg neg IHQ Men poly neg
8 E45.411 Strepto neg neg IHQ Men poly neg
9 E45.459 Strepto neg neg IHQ Men poly neg
10 E37.861 Rubéola neg neg IHQ Rubéola positivo
Legenda: n. IHQ – número da imuno-histoquímica; PCR – reação em cadeia da polimerase; NM e NL – anticorpos monoclonais; Men – anticorpo policlonal para Neisseria meningitidis sorogrupo específico; Strepto – Streptococcus pneumoniae.
De acordo com a tabela 2, os dois anticorpos monoclonais apresentaram positividade na reação de IHQ, vista em ambas as lâminas e confirmados os resultados, com os anticorpos policlonais para N. meningitidis e pelo PCR.
Todos os casos analisados apresentavam positividade no PCR para N. meningitidis. Ter esta metodologia na rotina como comparativo nas reações IHQ auxilia os patologistas, juntamente com o quadro clínico e análise histopatológica, apresenta uma confiabilidade maior para a tomada de decisões.
Nos casos de N. meningitidis, a marcação nas lâminas que apresentavam os meningococos pode ser visualizada por meio do cromógeno Naftol-Fast Red, que têm uma coloração vermelha, como visto na figura 14. Esta bactéria tem como estrutura um
diplococo, que é facilmente visualizada nos vasos da meninge ou no parênquima cerebral.
Figura 14 – Avaliação da melhor diluição dos Anticorpos Monoclonais. Caso E43929, tecido cerebral empregando-se a técnica de IHQ com anticorpo monoclonal NL nas diluições 1:1000 (A) e 1:2000 (B). Aumento 400 X.
Figura 15 – Avaliação da melhor diluição dos Anticorpos Monoclonais. Caso E43929, tecido cerebral empregando-se a técnica de IHQ com anticorpo monoclonal NM nas diluições 1:2 (A) e 1:5 (B). Aumento 400 X.
Nas figuras 14 e 15, temos a aplicação da técnica de IHQ realizadas no tecido cerebral para o caso E43929 positivo para N. meningitidis, sorogrupo C, com os dois anticorpos monoclonais NL e NM. Neste caso, o PCR, o anticorpo policlonal anti-N.
meningitidis e os anticorpos monoclonais obtiveram resultados positivos para N. meningitidis. Conseguimos comprovar esta positividade por meio das marcações em
vermelho, principalmente no vaso cerebral. De acordo com a diluição aplicada na lâmina, resulta em diferentes intensidades desta marcação.
A B
Na figura 16, temos o caso E44423, positivo para N. meningitidis, sorogrupo B. Nele foi realizado a técnica de IHQ com os anticorpos policlonal contra N. meningitidis na diluição 1:10000, os anticorpos monoclonais NL e NM na diluição 1:10 e em paralelo, foi feito o PCR para N. meningitidis, sendo positivo em ambos os ensaios.
Figura 16 – Avaliação da diluição 1:10 dos anticorpo NL e NM. Caso E44423 empregando-se a técnica de IHQ no tecido cerebral. Anticorpos policlonal (A e B) contra N. meningitidis diluição 1:10000 e anticorpos monoclonais NL (C) e NM (D). Aumento 400 X.
Podemos observar nas imagens que a reação com o anticorpo NL (figura 16 - C) na diluição 1:10 ocorreu uma reação de fundo escura e coloração inespecífica que nos atrapalhasse na análise do caso. Enquanto que com o anticorpo NM (figura 16- D) na mesma diluição, a reação ficou clara, um pouco fraca as marcações, apesar de conseguirmos ver uma marcação leve dentro do vaso. Resolvemos manter a diluição 1:5 do anticorpo NM e a diluição 1:2000 no anticorpo NL, como testado no caso anterior. Com relação ao anticorpo policlonal, podemos observar que ocorre a mesma reação de fundo inespecífica, apesar da diluição ser bem alta do anticorpo. Comparando com os
A B
monoclonais, a coloração do policlonal é bem mais intensa o que dificulta na análise dos casos na rotina, levando a uma incerteza para a liberação de um laudo final.
Na rotina da IHQ, é padronizado o uso da fosfatase alcalina e a revelação com o cromógeno Fast Red nos casos de meningite por Neisseria meningitidis, por ser mais fácil de observar os meningococos em vermelho nos vasos cerebrais, quando realizado o exame microscópico. Por este motivo, resolvemos comparar outro cromógeno além do utilizado na rotina.
As colorações mais comuns em uma reação imunoenzimática são: marrom (peroxidase + DAB) e rósea (fosfatase alcalina + fast red). Em nossos estudos, além do cromógeno Fast Red utilizado para a padronização dos anticorpos, foi testado um outro cromógeno, o diaminobenzidina (DAB) que ao reagir com a peroxidase associada a estreptoavidina, emite uma coloração marrom. Podemos observar na figura 17 uma reação IHQ realizada com os dois cromógenos.
Figura 17 – Comparação de dois cromógenos diferentes, no tecido cerebral, empregando-se a técnica de IHQ no caso E45261, utilizando o anticorpo monoclonal NL 1:2000, com colorações diferentes - rósea - fosfatase alcalina + fast red (A) e marrom - peroxidase + DAB (B). Aumento 400 X.
Além dos testes realizados com diferentes diluições dos anticorpos monoclonais e com os dois cromógenos exemplificados na figura 17, os monoclonais NL e NM foram testados em controles negativos. Utilizamos como controles casos de Streptococcus
pneumoniae, Rickettsia rickettsii e um caso com diagnóstico de Rubéola. Os resultados
estão contemplados na tabela 2.
Não foi observado marcação positiva nos casos de S. pneumoniae, sendo o resultado negativo. Isto também confirmou o que foi visto nas lâminas com o anticorpo policlonal para N. meningitidis, que também não teve marcação.
Na lâmina de Rickettsia rickettsii, o policlonal para Rickettsia foi positivo. Quando aplicado o anticorpo policlonal contra N. meningitidis e os dois anticorpos monoclonais, o resultado foi negativo, como observado na tabela 2. O mesmo aconteceu no caso de rubéola, cujo anticorpo contra Rubéola foi positivo e nos dois monoclonais deram negativos (Figura 18).
Figura 18 – Utilização dos anticorpos monoclonais em tecido cerebral no caso E37861, com diagnóstico de rubéola. O resultado foi negativo, não houve marcação utilizando anticorpos monoclonais NL 1:1000 (A) e 1:2000 (B) e NM 1:2 (C) e 1:5 (D) empregando-se a técnica de IHQ com o cromógeno Fast Red. Aumento 400 X.
Isso nos mostrou que, nestes resultados preliminares, os dois anticorpos monoclonais obtiveram excelentes resultados. Não houve reatividade cruzada com S.
pneumoniae, Rickettsia rickettsii ou Rubéola.
A B
As técnicas para diagnósticos laboratoriais para meningites apresentam vantagens e desvantagens quanto a execução e interpretação de resultados, custo elevado com a obtenção de reagentes e reprodutibilidade. No entanto, a escolha do método deve buscar sempre a eficiência no diagnóstico com elevada confiabilidade de seus resultados.
A técnica de IHQ, por ser um método rápido e efetivo, pode ser utilizada na rotina em casos no qual inicialmente há suspeita de doença meningocócica. Na qual são utilizadas amostras de tecido humano, principalmente de cérebros, que auxiliam no diagnóstico e no estudo dos mecanismos patogênicos da bactéria.
Ensaios IHQ possibilitam a detecção das bactérias e de seus antígenos, mantendo as características morfológicas do tecido. No caso da bactéria N. meningitidis, encontrada exclusivamente nos tecidos humanos, a técnica de imuno-histoquímica é utilizada para melhor compreender a doença meningocócica, auxiliando na validação do que se têm observado em estudos in vitro. (ROSENSTEIN, 2001)
A análise IHQ feita em amostras de tecido fixados em formol e emblocados em parafina oferecem várias vantagens, incluindo um diagnóstico específico para N.
meningitidis, preservação das características morfológicas do tecido (que permite a
localização dos meningococos em células específicas) (GUARNER, 2004), registro permanente por meio das lâminas e redução do risco biológico para o pessoal de laboratório que trabalham com material parafinado (ALVES, 1999).
A técnica de IHQ utiliza anticorpos para identificar a localização de antígenos em células e tecidos, assim se tornou uma das ferramentas mais poderosas para a biologia celular. A potencialidade do emprego de anticorpos monoclonais de especificidade muito bem definida em ensaios diagnósticos é enorme (GRIFFITHS; LUCOCQ, 2014).
Após a padronização em 10 casos, utilizamos um número maior de amostras com objetivo de comprovar a eficiência e sensibilidade dos dois anticorpos monoclonais na reação de imuno-histoquímica. A tabela 3 contempla todos os 50 casos que foram realizados os ensaios imuno-histoquímicos, com o número da lâmina do paciente, o sexo, a idade do paciente, o município que a amostra veio, os dois anticorpos utilizados e por último, o agente etiológico que foi encontrado na amostra.
Tabela 3 – Reatividade dos anticorpos monoclonais NL e NM contra N. meningitidis no ensaio imuno-histoquímico para cada caso selecionado.
CASOS SEXO IDADE MUNICÍPIO PCR ANTICORPO
NL 1:2000
ANTICORPO NM 1:5
1 E41120 M 18 A São José do Rio Preto N. meningitidis + + 2 E43096 M 30 A São Caetano do Sul N. meningitidis + + 3 E43886 F 62 A São Paulo N. meningitidis + + 4 E43929 M 30 A Penápolis N. meningitidis + + 5 E44423 M 05 m Guarulhos N. meningitidis + + 6 E44437 M 19 A São Paulo N. meningitidis + + 7 E44858 M 43 A Guarulhos N. meningitidis + + 8 E45404 F 46 A Ribeirão Preto N. meningitidis + + 9 E45462 F 04 A Guarulhos N. meningitidis + + 10 E45808 M 24 A Presidente Prudente N. meningitidis + + 11 E47149 M 02 A Ribeirão Preto N. meningitidis + + 12 E47294 M 02 A Ribeirão Preto N. meningitidis + + 13 E47434 M 02 A Ribeirão Preto N. meningitidis + + 14 E47537 M 32 A Campo Grande N. meningitidis + + 15 E47699 F 19 A Guarulhos N. meningitidis + + 16 E47702 M 19 A São Paulo N. meningitidis + + 17 E47711 F 30 A Guapiaçu N. meningitidis + + 18 E47712 M 14 A São José do Rio Preto N. meningitidis + + 19 E43475 M NI São Paulo Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
20 E43742 F 21 A Diadema Neg p/ N.
meningitidis Neg Neg
21 E43928 M 01 A São Paulo Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
22 E47429 F 20 A Guarulhos Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
23 E47472 M 35 A Guarulhos Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
24 E47637 F 12 A Osasco Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
25 E47683 M 24 A Ribeirão Preto Neg p/ N.
meningitidis
Neg Neg
26 E47783 M 61 A Taubaté Neg p/ N.
meningitidis
27 E44430 F 05 m São José do Rio Preto S. pneumoniae Neg Neg 28 E44436 M 03 A São Paulo S. pneumoniae Neg Neg 29 E45459 M 46 A Osasco S. pneumoniae Neg Neg 30 E46255 F 30 A Mogi das Cruzes S. pneumoniae Neg Neg 31 E47046 M 50 A Taubaté S. pneumoniae Neg Neg 32 E47464 M 17 A São José do Rio Preto S. pneumoniae Neg Neg 33 E47542 F 07 A Américo Brasiliense S. pneumoniae Neg Neg 34 E47682 F 64 A Ribeirão Preto S. pneumoniae Neg Neg 35 E47753 M 67 A São José do Rio Preto S. pneumoniae Neg Neg 36 E47852 M 45 A Ribeirão Preto S. pneumoniae Neg Neg 37 E43938 M 05 A São Paulo H. influenzae Neg Neg 38 E45054 M 08 m Guarulhos H. influenzae Neg Neg 39 E47021 M 15 A Osasco H. influenzae Neg Neg 40 E47475 M 50 A Jundiaí Não realizado
Rickettsia rickettsii
Neg Neg
41 E47683 M 24 A Ribeirão Preto Não realizado Rickettsia
rickettsii
Neg Neg
42 E47684 M 44 A Indaiatuba Não realizado Rickettsia
rickettsii
Neg Neg
43 E47768 M 02 A Santo André Não realizado Rickettsia
rickettsii
Neg Neg
44 E44614 F 02 A Américo Brasiliense Não realizado Influenza A
Neg Neg
45 E46068 F 42 A São José do Rio Preto Não realizado Influenza A
Neg Neg
46 E44663 M 20 A Ribeirão Preto Não realizado Dengue
Neg Neg
47 E44782 M 49 A São José do Rio Preto Não realizado Dengue
Neg Neg
48 E44842 F 46 A São Paulo Não realizado Dengue
Neg Neg
49 E46728 F 09 A Mogi das Cruzes Não realizado Varicela
Neg Neg
50 E47573 F 36 A Águas de Lindóia Não realizado
Cryptococcus sp
Neg Neg
Legenda: n. E – número da imuno-histoquímica; Sexo – M: masculino e F: feminino; Idade - A: anos e m: meses; Anticorpos NM e NL – anticorpos monoclonais; Neg: negativo; + : positivo; N. meningitidis - Neisseria meningitidis; S. pneumoniae - Streptococcus pneumoniae; H. influenzae – Haemophilus influenzae; Neg p/ N. meningitidis – PCR negativo para Neisseria meningitidis.
Como visto na tabela 3, há uma homologia entre os resultados. Porém, além da reação de imuno-histoquímica, de acordo com a literatura, as meningites possuem um predomínio celular que auxilia no diagnóstico histopatológico das amostras. Na tabela 4, apresentamos os tipos celulares comparativamente que aparecem nas meningites bacterianas e virais (FOCHESATTO, 2013).
Tabela 4 – Análise do predomínio celular das meningites bacteriana e viral, baseados na literatura de Fochesatto, 2013.
MENINGITE CÉLULAS PREDOMÍNIO CELULAR
MENINGITE BACTERIANA AGUDA NEUTRÓFILOS POLIMORFONUCLEARES MENINGITE BACTERIANA PURULENTA LINFÓCITOS, NEUTRÓFILOS E MONÓCITOS POLIMORFONUCLEARES
MENINGITE VIRAL LINFÓCITOS MONONUCLEARES
Para correlacionar o predomínio celular dos achados histopalógicos das amostras com a literatura, analisamos especificamente 22 casos do estudo, de diferentes patógenos, com seus respectivos predomínios celulares e contemplamos na tabela 5. Tabela 5 – Análise do predomínio celular dos casos selecionados do levantamento feito no NAP-IAL.
CASOS PREDOMÍNIO CELULAR AGENTES ETIOLÓGICOS
1 E44663 INFILTRADO LINFOMONONUCLEAR Dengue