5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Variação do meio de cultura
Os perfis metabólicos foram obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando detectores de ultravioleta e espectrometria de massas, com exceção das frações em ACN provenientes dos meios sólidos de arroz, que foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando apenas detector de ultravioleta. Todas as análises cromatográficas foram feitas em gradiente exploratório (5-100% de MeOH em 40 minutos). O potencial citotóxico dos extratos foi analisado, porém, não houve variação significativa. Resultado coerente com a semelhança entre os perfis cromatográficos dos extratos
Comparando os cromatogramas obtidos a partir dos extratos provenientes dos meios de cultura a base de malte, observou-se uma variação nos picos em 10, 15, 24, 29 e 31 minutos (Figuras 22 e 23, p. 53).
Figura 22 - Cromatograma do extrato MALT-MQ obtido por CLAE-DAD-EM
Figura 24 - Cromatograma do extrato PDB-MQ obtido por CLAE-DAD-EM
Figura 25 - Cromatograma do extrato PDB-MAR obtido por CLAE-DAD-EM
Figura 27 - Cromatograma do extrato NUT-MQ obtido por CLAE-DAD-EM
Figura 28 - Cromatograma do extrato NUT-NH4 obtido por CLAE-DAD-EM
Os extratos provenientes dos meios de cultura a base de batata e dextrose (Figuras 24 a 26, p. 54) não apresentaram variação significativa, e os extratos dos meios a base de extrato de carne (Figuras 27 e 28, p. 55) apresentaram mudança apenas nos picos em 38 minutos.
Pelos cromatogramas obtidos por CLAE-DAD das frações ACN dos meios sólidos (Figuras 29 e 30, p. 56), observou-se uma mudança apenas na proporção dos metabólitos produzidos.
Figura 29 - Cromatograma do extrato C80-MQ obtido por CLAE-DAD
Figura 30 - Cromatograma do extrato C80-MAR obtido por CLAE-DAD
5.2 - Variação do tempo de cultura
O perfil cromatográfico dos extratos obtidos (30-50% MeOH em 15’, 50-100% em 15’) pela variação do tempo de cultivo do endófito em meio sólido de arroz, não apresentou grande mudança no intervalo de tempo monitorado, porém, apresentou grande variação na proporção das substâncias produzidas (Figuras 31 a 34, p. 57).
Os picos em 26 e 29 minutos estão presentes no extrato de 10 dias e praticamente ausentes no extrato de 40 dias, o inverso observado com os picos em 15 minutos, assim, os extratos de 20 e 30 dias apresentaram uma proporção mais homogênea dos metabólitos.
Figura 31 - Cromatograma da amostra C80-10D
Figura 32 - Cromatograma da amostra C80-20D
Figura 33 - Cromatograma da amostra C80-30D
5.3 - Determinação estrutural e identificação das substâncias isoladas
Neste trabalho foram isolados seis metabólitos, do fungo endofítico C80, identificados como policetídeos aromáticos (Figura 35, p. 58). As respectivas estruturas foram determinadas através de análises por RMN de 1H, 13C e EM.
5.3.1 - Substância 1
Figura 36 - Estrutura proposta para a substância 1
7-hidroxi-3-(1-hidroxietil)-5-metoxi-3,4-dimetilisobenzofuran-1(3H)-ona
O espectro de RMN de 1H da substância 1 (Apêndice 2) apresenta sinais característicos de hidrogênios metoxílico com δH 3,87 (3H, s), e hidrogênios
metílicos com δH 0,94 (3H, d, J=6,5) acoplando com um hidrogênio oximetínico de δH
4,24 (1H, q e J=6,5). Além de um sinal com δH 6,43 (1H, s) indicando um hidrogênio
aromático protegido, e de dois sinais de hidrogênios metílicos mais desblindados em δH 1,80 (3H, s) e δH 2,11 (3H, s).
No espectro de RMN de 13C (Apêndice 3) pôde-se observar seis sinais na região de carbonos aromáticos, sendo que um deles apresentou sinal em δC 156,5
indicando um carbono hidroxilado e outro em δC 165,4, referente a um carbono
ligado a uma metoxila. Observou-se ainda um sinal em δc 171,5 indicando a
presença de uma carbonila de lactona; um sinal de metila aromática em δc 11,2,
duas metilas alifáticas em δC 21,2 e δC 17,8 e um sinal em δC 70,9 indicando um
carbono sp3 oxigenado.
Tabela 8 – Dados de RMN de 1H (CDCl3, 300MHz) e 13C (CDCl 3, 125MHz) para a substância 1 Carbono δH (m,J) δC 1 - 171,5 3 - 91,9 3a - 149,9 4 - 112,2 5 - 165,4 6 6,43 (s) 98,2 7 - 156,5 7a - 103,0 8 4,24 (q, 6,5) 70,9 9 0,94 (d, 6,5) 17,8 10 1,80 (s) 21,2 11 2,11 (s) 11,2 12 3,87 (s) 56,3
Através do experimento de HMQC (Apêndice 4), os carbonos ligados à hidrogênios foram relacionados, e pelo mapa de correlações à longa distância HMBC (Apêndice 5) pôde-se confirmar a posição da metoxila, hidroxila e metilas. A substância 1 teve a fórmula molecular C13H16O5 confirmada pela análise dos
espectros de EMAR-IES (Apêndices 6 e 7) onde foi visualizado o pico base m/z 275,0888 (calc. para C13H16O5Na, 275,0895) no modo positivo e m/z 251,0909 (calc.
para C13H15O5, 251,0919), indicando a formação dos íons [M+Na]+ e [M-H]-,
respectivamente.
Esta estrutura foi descrita pela primeira vez por Tayone et al. (2011b), produzida pelo fungo Leptosphaeria sp., coletado em detritos de madeira, no Japão.
5.3.2 - Substância 2
Figura 38 - Estrutura proposta para a substância 2
3,7-dihidroxi-5-metoxi-3,4-dimetilisobenzofuran-1(3H)-ona
O espectro de RMN de 1H da substância 2 (Apêndice 8) apresentou sinais característicos de hidrogênios metoxílico com deslocamento químico δH 3,74 (3H, s),
de um hidrogênio aromático protegido de δH 6,24 (1H, s) e de hidrogênios metílicos
desblindados com δH 2,15 (3H, s) e δH 1,90 (3H, s).
No espectro de RMN de 13C (Apêndice 9) pôde-se observar um sinal em δC
172,5 indicando a presença de uma carbonila de éster, seis sinais na região de carbonos aromáticos, sendo que um deles apresentou sinal em δC 158,7 indicando
um carbono hidroxilado e outro em δC 163,9, referente a um carbono ligado a uma
metoxila. O sinal em δC 112,9 apresentou maior intensidade em relação aos outros
carbonos quaternários, sendo assim atribuído à sobreposição de sinais do C3 e C4. Uma metila aromática com δC 10,6, outra metila com δC 28,8 e um sinal em δC 56,0
indicando uma metoxila aromática.
Analisando os dados obtidos por EM-IES (Apêndices 10 e 11) onde foi visualizado o pico de m/z 223,15 no modo negativo, atribuído à formação do íon [M-H]-, e o pico de m/z 247,07 no modo positivo, atribuído à formação do íon
[M+Na]+, indicando a fórmula molecular C
Tabela 9 – Dados de RMN de 1H (CDCl3, 300MHz) e 13C (CDCl 3 75MHz) para a substância 2 Carbono δH (m,J) δC 1 - 172,5 3 - 112,9 3a - 146,6 4 - 112,9 5 - 163,9 6 6,24 (s) 99,1 7 - 158,7 7a - 104,8 8 1,90 (s) 28,8 9 2,15 (s) 10,6 10 3,74 (s) 56,0 5.3.3 - Substância 3
Figura 39 - Estrutura proposta para a substância 3
7-hidroxi-3-(1,2-dihidroxietil)-5-metoxi-3,4-dimetilisobenzofuran-1(3H)-ona
O espectro de RMN de 1H da substância 3 (Apêndice 12) apresentou sinais característicos de hidrogênios metoxílico com δH 3,88 (3H, s), um hidrogênio
aromático protegido em δH 6,50 (1H, s), e hidrogênios metílicos desblindados em δH
2,16 (3H, s) e em δH 1,74 (3H, s). Além de três duplo dubletos em δH 4,12 (1H, dd,
J=8,2 e 3,1), δH = 3,38 (1H, dd, J=11,4 e 8,2) e δH = 3,18 (1H, dd, J=11,4 e 3,1),
No espectro de RMN de 13C (Apêndice 13) pôde-se observar um sinal em δc
171,4 indicando a presença de uma carbonila de éster, seis sinais na região de carbonos aromáticos, sendo que um deles apresentou sinal em δC 158,3 indicando
um carbono hidroxilado e outro em δC 166,5, referente a um carbono ligado a uma
metoxila. Um sinal em δc 11,6 da metila aromática, outra metila com δC 22,0, um
sinal em δC 56,8 indicando uma metoxila aromática e três sinais indicando carbonos
sp3 ligados a oxigênio em δC 90,2, δC 76,1 e δC 63,1.
Figura 40 - Correlações observadas pelo mapa de contorno HMBC
Tabela 10 – Dados de RMN de 1H (CD3OD, 300MHz) e 13C (CD3OD, 100MHz) para
a substância 3, comparados com dados da literatura* p/ Clearanol D [Gerea et al. (2012)]. Carbono δH (m,J) δC δH (m,J)* δC* 1 - 171,4 - 171,5 3 - 90,2 - 90,4 3a - 152,3 - 152,4 4 - 113,1 - 113,3 5 - 166,5 - 166,6 6 6,50 (s) 99,7 6,49 (1H; s) 99,9 7 - 158,3 - 158,3 7a - 104,4 - 104,6 8 4,12 (dd; 8,2; 3,1) 76,1 4,11 (1H; dd; 8,2; 2,7) 76,2 9 3,38 (dd; 11,4; 8,2); 3,18 (dd; 11,4; 3,1) 63,1 3,34 (1H; dd; 11,3; 8,6); 3,14 (1H; dd; 11,3; 2,7) 63,3 10 1,74 (s) 22,0 1,73 (3H; s) 22,1 11 2,16 (s) 11,6 2,15 (3H; s) 11,7 12 3,88 (s) 56,8 3,88 (3H; s) 56,9
Através do experimento HMQC (Apêndice 15), os carbonos ligados à hidrogênios foram relacionados, e pelo mapa de correlações à longa distância HMBC (Apêndice 14) pôde-se confirmar a posição da metoxila, hidroxila e metilas.
Análises por EMAR-IES no modo positivo (Apêndice 16) e negativo (Apêndice 17) permitiram a visualização dos picos de m/z 291,0838 e 267,0865, respectivamente. Picos atribuídos à formação dos íons [M+Na]+ (calc. para C13H16O6Na 291,0845) e [M-H]- (calc. para C13H15O6 267,0869), confirmando a
fórmula molecular C13H16O6 proposta.
5.3.4 - Substância 4
Figura 41 - Estrutura proposta para a substância 4
7-hidroxi-3-(1,2-dihidroxietil)-5-metoxi-3,4-dimetilisobenzofuran-1(3H)-ona
Análises por EMAR-IES indicaram a mesma fórmula molecular da substância anterior, C13H16O6, pela visualização dos picos de m/z 291,0836 e 267,0869 no
modo positivo (Apêndice 22) e negativo (Apêndice 23), respectivamente. Picos atribuídos à formação dos íons [M+Na]+ (calc. para C
13H16O6Na 291,0845)e [M-H]-
(calc. para C13H15O6 267,0869).
Os espectros de RMN de 1H (Apêndice 18), 13C (Apêndice 19), e as
correlações a curta e longa distância também foram muito semelhantes aos da substância 3, havendo uma mudança significativa apenas no deslocamento de um duplo dubleto dos hidrogênios em C-9, agora com δH 3,87ppm (1H, dd, J=11,4 e
3,6).
Assim, a estrutura proposta é do epímero da substância 3, com inversão da configuração no carbono 8.
Tabela 11 - Dados de RMN de 1H (CD3OD, 300MHz) e 13C (CD3OD, 100MHz) para
a substância 4, comparados com dados da literatura* p/ Clearanol E [Gerea et al. (2012)]. Carbono δH (m,J) δC δH (m,J)* δC* 1 - 171,9 - 171,9 3 - 90,5 - 90,6 3a - 153,0 - 153,1 4 - 113,2 - 113,4 5 - 166,3 - 166,4 6 6,48 (s) 99,4 6,47 (1H; s) 99,5 7 - 157,7 - 157,8 7a - 105,3 - 105,4 8 4,15 (dd; 7,8; 3,6) 75,6 4,13 (1H; dd; 8,0; 3,7) 75,7 9 3,87 (dd; 11,4; 3,6); 3,57 (dd; 11,4; 7,8) 63,7 3,83 (1H; dd; 11,3; 3,5); 3,53 (1H; dd; 11,3; 8,2) 63,9 10 1,68 (s) 21,9 1,67 (3H; s) 22,1 11 2,19 (s) 11,2 2,18 (3H; s) 11,4 12 3,88 (s) 56,7 3,87 (3H; s) 56,9
As substâncias 3 e 4 tiveram suas estruturas elucidadas em mistura por Gerea et al. (2012), obtidas de um Dotideomiceto isolado de uma camada microbiana presente em águas doces e ricas em ferro, nos E.U.A..
5.3.5 - Substância 5
Figura 42 - Estrutura proposta para a substância 5
Como já mencionado, a substância 5 havia sido isolada no trabalho de monografia, onde teve sua estrutura determinada pela análise dos espectros de RMN de 1H (Apêndice 25) e 13C uni e bidimensionais, e EMAR-IES.
O espectro de RMN de 1H da substância 5 (Apêndice 24) apresentou um sinal de hidrogênio aromático mais blindado de δH 6,43, um sinal de hidrogênios
metoxílico com δH 3,86 e duas metilas mais desblindadas com δH 2,38 e δH 1,72.
Além de um dubleto com δH 5,09 e outro com δH 4,95, característicos de
hidrogênios de carbono sp2.
A estrutura de fórmula molecular C13H14O5 foi confirmada por uma nova
análise por EMAR-IES (Apêndice 26), onde foi observado um sinal de m/z 251,0911 no modo positivo, atribuído à formação do íon [M+H]+ (calc. para C13H15O5
251,0919).
Esta estrutura foi descrita pela primeira vez por Chinworrungsee et al. (2002), obtida do fungo marinho Halorosellinia oceanica, coletado na Tailândia.
Tabela 12 – Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500MHz) para a substância 5
Carbono δH (m,J) 1 - 3 - 4 - 4a - 5 - 6 - 7 6,43 (s) 8 - 8a - 9 5,09 (d; 2); 4,95 (d, 2) 10 1,72 (s) 11 2,38 (s) 12 3,86 (s)
5.3.6 - Substância 6
Figura 43 - Estrutura proposta para a substância 6
8-hidroxi-6-metoxi-4,5-dimetil-3-metilenoisocroman-1-ona Tabela 13 – Dados de RMN de 1H (CDCl 3, 300MHz) para a substância 6 Carbono δH (m,J) 1 - 3 - 4 3,85 (dq; 7,2; 0,3) 4a - 5 - 6 - 7 6,38 (s) 8 - 8a - 9 4,79 (dd; 1,8; 0,6) 4,56 (d; 2,1) 10 1,38 (d; 7,2) 11 2,07 (s) 12 3,86 (s)
O espectro de RMN de 1H da substância 6 (Apêndices 27 e 28) apresentou sinal característico de hidrogênios metoxílico com δH 3,86 (3H, s), um sinal de
hidrogênio aromático protegido com δH 6,38 (1H, s), e uma metila mais desblindada
com δH 2,07. Além de outra metila com δH 1,38 (3H, d, 7,2) acoplando com um
hidrogênio metínico de δH 3,85 (1H, dq, 7,2; 0,3). Este hidrogênio metínico gerou um
“quarteto de sinal largo”, em consequência da sobreposição de dois quartetos separados por um discreto acoplamento alílico com hidrogênios em C-9. O acoplamento alílico foi muito pequeno, e apenas pôde ser observado no hidrogênio de δH 4,79 (1H, dd, 1,8; 0,6), indicando que a ligação σ C9–H está perpendicular ao
orbital π C3-C9.
A fórmula molecular C13H14O4 foi confirmada analisando os dados obtidos por
EMAR-IES no modo positivo (Apêndice 29), onde foi visualizado o pico base com m/z 235,0969, atribuído à formação do íon [M+H]+ (calc. para C13H15O4 235,0970).
Esta estrutura foi descrita pela primeira vez por Tayone et al. (2011a), também isolada do fungo Leptosphaeria sp. descrito anteriormente.
5.4 - Identificação das substâncias isoladas no extrato bruto
Todas as substâncias isoladas foram identificadas no extrato bruto por CLAE- DAD através de co-injeção. Os cromatogramas foram obtidos em gradiente de 30- 50% MeOH em 15 minutos, seguido de 50-100% MeOH em mais 15 minutos (Apêndices 35 a 40).
Figura 44 - Substâncias identificadas no extrato bruto
3 4
2
1 5
5.5 - Modificações estruturais na substância 1
Estudos preliminares demostraram que a substância 1 apresentava potencial citotóxico moderado frente às três linhagens tumorais OVCAR (carcinoma de ovário), HCT-116 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano). Estes testes foram realizados em parceria com o Laboratório Nacional de Oncologia Experimental – UFC. Em função do resultado positivo, a substância 1 foi submetida à pequenas transformações químicas, a fim de se verificar uma variação em sua atividade citotóxica.
Foram conduzidas duas reações separadamente, uma acetilação e uma oxidação. Ambas as reações formam um produto com menor polaridade, o que facilitaria a sua permeação pelas membranas celulares. A reação de acetilação foi realizada utilizando anidrido acético e catalisada por piridina. Na oxidação foi utilizado o reagente de Jones em meio de acetona. Cada reação gerou um produto, os quais foram identificados por RMN de 1H e EMAR-IES.
5.5.1 - Acetilação
Na acetilação, foram reagidos 12mg da substância 1 em um balão reacional, onde foram adicionados 4mL de anidrido acético e 0,1mL de piridina. Após 24h de reação sob agitação e em temperatura ambiente, o balão foi seco em evaporador rotativo, e então o produto (14mg) foi encaminhado para análises espectroscópicas, espectrométricas e ensaio citotóxico.
Comparando os espectros de RMN de 1H do material de partida e do produto formado (Apêndice 30), verificou-se o aparecimento de dois sinais de metilas desblindadas de δH 2,26 (3H, s) e δH 2,39 (3H, s), indicando a acetilação de ambas
as hidroxilas. Outra mudança no espectro que indica dupla acetilação é a desblindagem dos hidrogênios aromático e oximetínico. A acetilação da hidroxila aromática diminui a sua contribuição na proteção orto/para do anel. O hidrogênio oximetínico foi quem sofreu maior mudança no deslocamento químico. Além da desblindagem causada pela esterificação do álcool, este próton provavelmente está sendo desblindado pela anisotropia magnética da carbonila adicionada ao seu ambiente.
A fórmula molecular C17H20O7 foi confirmada pela análise por EMAR-IES no
modo positivo (Apêndice 31), onde foi observado o pico base de m/z 359,1106, atribuído à formação do íon [M+Na]+ (calc. para C17H20O7Na 359,1107).
5.5.2 - Oxidação
Na oxidação foram reagidos cerca de 40mg da subfração 13, composta majoritariamente pela substância 1. Essa massa foi dissolvida em 5mL de acetona, onde o reagente de Jones foi gotejado até a observação de excesso do reagente. Em seguida foi feita uma extração líquido-líquido com AcOEt. A fração AcOEt foi seca em evaporador rotativo, e então o produto obtido (10mg) foi encaminhado para análises espectroscópicas e espectrométricas.
O produto esperado da oxidação havia sido isolado como natural no trabalho de monografia, assim, suas análises foram comparadas ao do produto natural e do material de partida (Apêndices 32 e 33). A substância natural isolada anteriormente teve a sua estrutura determinada por RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais, e EMAR-IES.
Comparando o espectro de RMN de 1H do produto formado com o da substância 1, pôde-se observar a ausência do quarteto referente ao hidrogênio oximetínico. Também foi possível observar a desblindagem de uma das metilas, que agora está ligada a uma carbonila, gerando um espectro com os mesmos sinais do produto natural isolado anteriormente.
A fórmula molecular C13H14O5 esperada para o produto da oxidação foi
confirmada por EMAR-IES (Apêndice 34). Foi detectado um pico base de m/z 251,0911 no modo positivo, atribuído à formação do íon [M+H]+ (calc. para C13H15O5
251,0919).
5.6 - Ensaio citotóxico
A atividade citotóxica de todas as amostras está apresentada na Tabela 14 (p. 72) com seus respectivos percentuais de inibição. Somente as substâncias que apresentarem valores de inibição ≥ 75 % em pelo menos duas linhagens tumorais são consideradas ativas, valor esse considerado como cut-off para o screening de novas substâncias com potencial antitumoral.
Tabela 14 - Análise do percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens tumorais. Valores são média ± DPM
Amostra OVCAR-8 SD HCT-116 SD SF-295 SD
Código GI% (média) GI% (média) GI% (média)
PDB-MQ -4,14% 2,05% 1,57% 0,30% 33,45% 1,96% PDB-MAR 11,90% 1,81% 18,94% 10,46% 35,95% 1,43% MALT-MQ 29,13% 4,70% -6,24% 13,91% 39,46% 6,55% MALT-NH4 23,24% 2,65% -11,55% 4,83% 28,82% 4,74% NUT-MQ 11,47% 11,82% 22,57% 0,20% 40,69% 6,32% NUT-NH4 25,12% 6,51% 0,38% 5,33% 38,35% 3,92% C80-MQ 43,03% 2,41% 31,64% 1,97% 47,50% 4,82% C80-10D 13,35% 0,96% 22,15% 1,78% 19,13% 0,68% C80-20D 6,35% 7,48% 4,22% 13,32% 25,57% 6,17% C80-30D 18,89% 1,09% 26,68% 2,86% 33,87% 0,75% C80-40D 28,96% 3,02% 24,45% 3,85% 38,24% 7,08% Substância 1 75,19% 7,24% 78,08% 6,70% 73,19% 10,68% Substância 2 5,76% 9,29% 41,75% 0,30% 68,22% 10,92% Substância 3 2,60% 0,48% 18,17% 0,30% 36,22% 10,99% Substância 4 -11,04% 12,79% 15,73% 3,16% 33,34% 7,38% Substância 5 10,02% 4,95% 27,80% 1,48% 46,60% 10,01% Substância 6 14,03% 2,41% 22,71% 0,00% 54,27% 0,23% Produto da Acetilação 5,84% 6,27% 15,38% 8,19% 69,12% 2,11% Produto da Oxidação 10,11% 2,17% 17,40% 0,59% 47,40% 7,08%
CONCLUSÕES
O estudo químico dos fungos associados às algas marinhas mostrou-se interessante devido à vasta extensão da costa brasileira ainda muito pouco explorada e a capacidade dos endofíticos de produzir compostos novos e bioativos.
A produção metabólica do endófito não apresentou mudança significativa entre os meios de cultura modificados, ao contrário do observado entre os meios comerciais de Malte e Nutriente.
Entre 10 e 40 dias de cultivo em meio sólido de arroz, observou-se grande mudança na proporção dos compostos produzidos. Este resultado levanta uma questão em respeito à produção/transformação dos compostos e mostra que o período de incubação do fungo pode ser ajustado de acordo com a substância de interesse.
O endófito apresentou boa reprodutibilidade do extrato bruto no decorrer de três anos de seu estudo, e as substâncias isoladas confirmam o potencial dos fungos endofíticos na busca por novas estruturas.
A possibilidade de mantermos o fungo preservado e submetê-lo a processos fermentativos permite a obtenção contínua e controlada do material de estudo, o que facilita a obtenção de amostras para ensaios biológicos e, consequentemente, viabiliza o estudo de organismos de origem marinha em regiões distantes do litoral.
As modificações estruturais na substância 1 diminuíram a atividade citotóxica da estrutura, mostrando que a hidroxila ligada ao C8 é importante para a atividade.
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