Todo o trabalho experimental realizado nesta tese foi dividido em duas etapas. Na primeira, foi utilizada caseína hidrolisada enzimaticamente (CHE) por Alcalase na composição tanto nos meios de germinação como nos de produção. Esta tinha sido a fonte de nitrogênio utilizada em todos os trabalhos de produção de PGA por Bacillus
megaterium desenvolvidos até então no DEQ/UFSCar (Hojo, 1997; Berazain, 1997;
Visnard, 1997 e Pinotti, 1999).
Segundo Gentina et al., 1997, caseína hidrolisada tem sido a fonte de nitrogênio
complexa mais amplamente utilizada e alguns trabalhos na literatura obtiveram maior produção de PGA utilizando esta como parte da composição dos meios (Illanes et al., 1994; Gentina et al., 1997). Não foram objetivos iniciais do trabalho experimental mudanças nas concentrações e nas fontes de nutrientes nos meios, principalmente com relação à fonte de nitrogênio. Sendo assim, nesta primeira etapa a maioria dos ensaios teve como objetivo respectivamente, estudos de viabilidade, verificação da pureza, adição de sais aos meios, verificação da quantidade de esporos e tempo de germinação, etc. Como não houve neste período melhoria significativa na produção da enzima, passou-se a investigar mudanças nas concentrações dos nutrientes e, principalmente, nas fontes de carbono e nitrogênio.
Apesar dos intensos trabalhos experimentais em câmara rotativa não se observou melhoria significativa na concentração de células e nem nos níveis de atividade enzimática. Com o andamento dos ensaios para identificar os requerimentos nutricionais do Bacillus megaterium, verificou-se que um meio contendo aminoácidos livres como fonte de nitrogênio em substituição à CHE era mais favorável à produção da enzima. Sendo assim, foi necessária a realização de novos ensaios em câmara rotativa e em biorreator com o novo meio. Esses ensaios, utilizando meio contendo aminoácidos, constituíram então a segunda etapa deste trabalho. Portanto, a primeira etapa abrange os ensaios realizados com caseína hidrolisada e a segunda etapa os ensaios com aminoácidos livres.
4.1 Ensaios em Câmara Rotativa – Primeira Etapa
Um intenso trabalho experimental foi realizado no decorrer desta tese. Na fase inicial, foi necessário verificar a estabilidade e a viabilidade de linhagem de Bacillus
megaterium que estava estocada na geladeira por um período de dois anos sem repique.
Os ensaios que se seguiram em câmara rotativa e em biorreator tiveram por objetivo aumentar o crescimento celular e conseqüentemente a produção da enzima e, quando possível, obter informações qualitativas das principais variáveis do processo. Todos os ensaios descritos a seguir foram realizados com caseína hidrolisada enzimaticamente por Alcalase.
4.1.1 Verificação da Estabilidade
A partir da linhagem de Bacillus megaterium mantida em tubo contendo ágar nutriente no DEQ/UFSCar, foram obtidos “slants” dos quais alguns foram utilizados em ensaio preliminar para se verificar a estabilidade do microorganismo. Uma vez verificada a viabilidade, os “slants” restantes foram utilizados nos ensaios de seleção e verificação da pureza da colônia.
O ensaio preliminar teve por objetivo verificar a viabilidade e estabilidade da linhagem de Bacillus megaterium que seria utilizada para a seleção/purificação da cultura. Para isso, reproduziu-se um dos ensaios de produção de PGA realizado em equipe com Pinotti (Pinotti, 1999), com adição de soro de queijo. O microorganismo que foi utilizado neste ensaio estava estocado em geladeira por um período de dois anos sem repique, e foi denominado em nosso laboratório de linhagem original. A Figura 4.1 mostra resumidamente o procedimento experimental deste ensaio e de ensaios posteriores de produção da enzima. Os resultados do ensaio de estabilidade são mostrados nas Tabelas 4.1 e 4.2.
Comparando-se os resultados mostrados nessas, observa-se que a enzima produzida pelo microorganismo armazenado apresentou atividade próxima dos valores obtidos por Pinotti, 1999 (Tabela 4.2), indicando a manutenção da viabilidade da cultura.
Tabela 4.1: Ensaio de estabilidade que reproduziu condições operacionais de Pinotti, 1999. Ensaio Tempo (horas) Concentração celular (g/L) Atividade Enzimática (UI/L) Inoculo 1,8 - 0 0,2 - 24 3,1 42 48 4,0 99 CHE – Alcalase (SQS) (ensaio 1) 72 4,1 97
SQS = Soro de queijo seco em atomizador CHE = Caseína hidrolisada enzimaticamente
Tabela 4.2: Ensaio original (num. 11) realizado por Pinotti, 1999. Ensaio Tempo (horas) Concentração Celular (g/L) Atividade Enzimática (UI/L) Inoculo 2,0 - 0 0,2 - 24 - 35 48 - 66 CHE – Alcalase (SQS) 72 3,05 102
SQS = Soro de queijo seco em atomizador CHE = Caseína hidrolisada enzimaticamente
4.1.2 Seleção e Verificação da Pureza do Bacillus megaterium
Foram realizados ensaios de seleção e verificação da pureza da cepa de Bacillus
megaterium ATCC 19945 visando a preparação do inoculo padrão. Os procedimentos
experimentais de verificação da pureza são mostrados, também resumidamente, na Figura 4.2. Do “slant”, o microorganismo foi inoculado no meio de seleção por 24 horas e após este tempo foram realizadas diluições sucessivas até se obterem as diluições desejadas de 10.000, 100.000 e 1.000.000.
Figura 4.2: Procedimento experimental utilizado nos ensaios de verificação da pureza da cultura.
A foto das placas após o aparecimento das colônias pode ser observada na Figura 4.3. Pode-se observar que uma melhor separação é obtida para a diluição de 1.000.000. Macroscopicamente, observou-se também o surgimento de duas colônias aparentemente diferentes. Diferença esta que é também observada na placas das diluições de 10.000 e 100.000.
Figura 4.3: Placas após o aparecimento de colônias em ordem crescente para as três diluições.
A Figura 4.4 mostra a placa com diluição de 1.000.000, onde se observa a melhor separação de colônias. Estas colônias foram denominadas de colônia A (aspecto denso e concentrado) e colônia B (aspecto menos denso e espalhado). A partir da diferença observada separaram-se as duas colônias em novos repiques em ágar nutriente e as colônias A e B foram cultivadas separadamente em meio líquido de germinação,