RESULTADOS

O primeiro tempo analisado foi o de 192 h.a.i., fase na qual o fungo produz os urediniósporos (Mortel et al., 2007; Tremblay et al., 2010). Neste tempo, a análise dos géis do genótipo PI561356 permitiu a observação de 1.449 spots bem resolvidos, com um número de matches igual a 790 sendo detectados quatro spots diferencialmente expressos, porém não identificados. A análise dos géis do genótipo Embrapa 48 permitiu a observação de 1.367 spots bem resolvidos com um número de matches igual a 779 sendo detectados cinco spots diferencialmente expressos dos quais três foram identificados. Estes spots identificados representam três proteínas mais expressas no inoculado: subunidade A da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (Cloroplasto), 1- desoxi-D-xilulose-5-fosfato-redutoisomerase (DXR) e anidrase carbônica. Na Figura 1 estão indicados os spots correspondentes a estas proteínas.

O segundo tempo analisado foi o de 72 h.a.i. Neste tempo, a análise dos géis do genótipo Embrapa 48 permitiu a observação de 716 spots bem resolvidos, com um número de matches igual a 580 não sendo detectados spots diferencialmente expressos. A análise dos géis do genótipo PI561356 permitiu a observação de 711 spots bem resolvidos, com um número de matches igual a 552 sendo detectados 13 spots diferencialmente expressos dos quais nove foram identificados. Estes spots identificados corresponderam a sete diferentes proteínas: proteína tumoral controlada traducionalmente, gama glutamil hidrolase, proteína ribossomal 30S de cloroplasto,

fator de elongação 1-alfa, proteína de ligação à subunidade beta da Rubisco (menos expressas no inoculado),

glutamina sintetase e frutose bisfosfato aldolase (mais expressas no inoculado). A Figura 2 mostra os spots referentes às proteínas identificadas e diferencialmente expressas no genótipo PI561356 72 h.a.i.

Figura 1- Spots correspondentes a proteínas diferencialmente expressas no genótipo Embrapa 48 (suscetível) 192 horas após inoculação (h.a.i.). I = inoculado; NI = não

inoculado. A) Subunidade A da gliceraldeído-3-fosfato-desidrognase; B)

xilulose -5-fosfato-redutoisomerase (DXR); C) Anidrase carbônica.

A subunidade A da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (Cloroplasto) apresentou um valor médio de %Vol para o inoculado igual a 0,332% e para o não inoculado igual a 0,155% sendo, portanto, 2,14 vezes mais expressa por efeito da inoculação (Figura 3).

A enzima 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato-redutoisomerase (DXR) foi 2,5 vezes mais expressa no inoculado como observado na Figura 3.

A enzima anidrase carbônica foi mais expressa no genótipo suscetível inoculado sendo identificada como ausente no não inoculado (192 h.a.i.) pelo software ImageMaster (Figura 1).

Figura 2 - Spots correspondentes a proteínas diferencialmente expressas no genótipo PI561356 (com resistência parcial) 72 horas após inoculação (h.a.i.). I= inoculado; NI = não inoculado. D) Proteína tumoral controlada traducionalmente; E) Gama glutamil hidrolase; F) Proteína ribossomal 30S de cloroplasto; G) Frutose bisfosfato aldolase; H) Fator de elongação 1-alfa; I) Glutamina sintetase; J, K e L) Proteína de ligação à subunidade beta da Rubisco.

Figura 3- Diferença de expressão das proteínas subunidade A da gliceraldeído-3- fosfato-desidrogenase (Cloroplasto) e 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato-redutoisomerase (DXR) com base na comparação entre valores médios da %Vol de spots do inoculado e do não-inoculado para o genótipo Embrapa 48, 192 h.a.i. I = inoculado; NI = não inoculado.

A anidrase carbônica é uma enzima que exerce funções importantes no cloroplasto e não deve estar ausente nas células do não inoculado, mas uma das limitações da técnica da eletroforese 2D é que proteínas de baixa concentração podem não ser detectadas. Na análise de imagem no software ImageMaster, estabelecemos parâmetros mínimos de identificação de spots, como saliência, smooth e área mínima e se o spot está aquém destes parâmetros, ele não é detectado. Mas, o importante é que fica evidente a maior expressão da anidrase carbônica nas plantas inoculadas.

A Figura 4 mostra a diferença de expressão de proteínas 72 h.a.i. no genótipo resistente. Pela análise dos gráficos observa-se que houve proteínas menos expressas por efeito da inoculação e uma que foi mais expressa. Na Tabela 1 estão os valores das diferenças de expressão de cada proteína identificada, de ambos os tempos analisados, com base na comparação dos valores médios de %Vol dos spots entre plantas inoculadas e não inoculadas. O Spot correspondente à proteína frutose bisfosfato aldolase foi detectado apenas nos géis do inoculado (Figura 2) e a ela aplica-se a mesma interpretação dada para a anidrase carbônica.

Figura 4- Diferença de expressão de proteínas no genótipo PI561356 com base na comparação entre valores médios da %Vol de spots correspondentes a cada proteína para o inoculado e para o não-inoculado 72 h.a.i. I = inoculado; NI = não inoculado.

Tabela 1 - Proteínas diferencialmente expressas no genótipo Suscetível 192 h.a.i. e no genótipo resistente 72 h.a.i. e seus respectivos valores de diferença de expressão entre o inoculado e não inoculado. O sinal (+) indica o aumento de expressão em resposta ao P.

pachyrhizi. O sinal (-) indica diminuição da expressão.

A Tabela 2 mostra dados de identificação das dez proteínas cujos peptídeos trípticos foram analisados em espectrômetro de massas MALDI-TOF-TOF para a obtenção das listas de suas massas. Estes dados foram úteis para identificar cada uma delas por meio do software MASCOT DAEMON que confronta massas obtidas experimentalmente com as teóricas existentes em bancos de dados públicos, tanto para a lista de massas de espectros resultantes de peptídeos trípticos (PMF) como para a lista de massas de espectros resultantes da fragmentação de cada um destes peptídeos trípticos. Para cada proteína, foi determinado o valor de score encontrado pela análise do PMF e o número de peptídeos que foram fragmentados para confirmar a identificação destas proteínas pelo PFF. Todos os espectros obtidos da fragmentação que foram utilizados para estas confirmações apresentaram valores de score significativos (dados não mostrados). Na Tabela 2 estão também o número de acesso da proteína e o banco de dados onde ela foi localizada.

Nome da Proteína Diferença de Expressão

Subunidade A da gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase (Cloroplasto) +2,14x 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato- redutoisomerase (DXR) +2,5x Embrapa 48 192 h.a.i.

Proteína tumoral controlada traducionalmente -1,49x

Gama glutamil hidrolase -2,46x

Proteína ribossomal 30S de cloroplasto -2,13x

Fator de elongação 1-alfa -1,97x

Glutamina sintetase +1,41 x

J – Proteína de ligação à subunidade beta da

Rubisco -3,58x

K – Proteína de ligação à subunidade beta da

Rubisco -2,86x

L – Proteína de ligação à subunidade beta da

Rubisco -2,25x

PI561356 72 h.a.i.

Tabela 2 - Proteínas diferencialmente expressas em folhas de soja em resposta a P.

pachyrhizi nos genótipos Embrapa 48 (Spot ID A-C) e PI561356 (Spot ID D-L).