Diante dos objetivos propostos, inicialmente observamos que foi possível padronizar as técnicas de seleção dos fagos reativos, tanto da biblioteca comercial, quanto dos fagos subtraídos e eluídos a partir dos anticorpos dos pacientes saudáveis (fig.02), como exemplo podemos citar a detecção dos melhores anticorpos (Ab 19 e Ab 72, respectivamente, anti-Fc humano feito em cabra conjugado a fosfatase alcalina e anti-IgM humana feito em cabra conjugado a fosfatase alcalina) que foram utilizados na captura dos anticorpos presentes no plasma dos sujeitos da pesquisa (fig.03 e 04). Mesmo que os anticorpos Ab 19 e 72 tenham apresentado um melhor desempenho pela ausência de um anticorpo conjugado para sua detecção, eles apresentaram um resultado aceitável quanto à captura, devido não apresentarem resposta cruzada, ou seja, o anticorpo anti-IgG (Ab19) não demonstrou um alto sinal de captura (Abs >0,1) quando desafiado contra a molécula de IgM, o mesmo aconteceu quando o anticorpo anti-IgM foi testado contra a molécula de IgG (Abs >0,1).
A ausência de um perfil diferencial utilizando a técnica de phage display, provavelmente se deve a presença de poucas sequências de indivíduos tolerantes e indivíduos com rejeição crônica para a devida comparação com as sequencias peptídicas obtidas até o presente momento (tabelas 03 a 08), assim como a necessidade de um maior número de sequências peptídicas dos indivíduos saudáveis para que se possa estabelecer um padrão de reatividades dos desses indivíduos ditos normais. Isso se deve até por uma dificuldade da técnica, já que o sequenciamento utilizado foi pelo método Sanger, onde apesar de ser uma metodologia de sequenciamento automático, as amostras devem ser preparadas uma-a-uma na placa de 96 poços. Pela metodologia do phage display, as seleções deveriam ser plaqueadas a partir de várias diluições de células, que foram previamente infectadas com os fagos selecionados pelos anticorpos. Como recomendação do kit (pH D. 12 Biolabs (# E8110S) as placas com mais de 100 colônias são pouco confiáveis. O que tornou laborioso o processo de obtenção de
colônias para serem seqüenciadas. Apesar disso, com as sequências obtidas conseguimos fazer uma análise prévia dos peptídeos selecionados pelos fagos, tanto dos eluídos quanto dos subtraídos. Nessa caracterização notamos que a freqüência de ponto isoelétrico (PI) encontrada na maioria das sequências é em torno de 6 a 7 ou 9 a 10 (fig.05). Mesmo assim, com uma porcentagem menor, foram encontrados peptídeos entre os PIs 3 a 5 e 7 a 8 (fig.05).
As análises relacionadas à distribuição dos aminoácidos que compõem as sequências peptídicas demonstram uma frequência bastante randômica, salvo algumas exceções. Nos peptídeos dos indivíduos saudáveis há indícios de uma predominância do aminoácido prolina nas posições 2 (SGS e EGS – fig.06 e 08), 4 (SMS, EGS e EMS – fig.07, 08 e 09 ), 8 e 12 (EGS – fig.08) e esta frequência se repete nas posições 4, 8 e 12 quando os peptídeos reconhecidos pelos indivíduos saudáveis são analisados em conjunto (fig.16)
Quanto aos peptídeos dos indivíduos tolerantes operacionais. Nas amostras SMT, há freqüência do aminoácido arginina na posição 6 (fig.10). Já nas amostras EGT (fig.11) o aminoácido prolina aparece na posição 4 e serina na posição 5. Nas posições 1 e de 6 a 12 a frequência de aminoácidos é muito randômica, provavelmente devido ao número de sequências obtidas ser muito baixo (n=10). Na figura 12 analisando as amostras EGT juntamente com as três sequência obtidas nas amostras EMT não houve alteração na frequência das posições 4 (P) e 5 (S), mas foi observado um pequeno aumento na frequência de serina nas posições 2 e 3, as demais posições não se alteraram. Quando as análises dos indivíduos tolerantes operacionais foram em conjunto nada significativo foi encontrado (fig.17).
Nos peptídeos dos indivíduos rejeição crônica, provavelmente devido ao baixo número de sequência obtidas (n=12), a frequência observada foi bastante randômica em todas as posições, salvo diferenças sutis entre as mostras eluídas (EGR e EMR – fig.13) e subtraídas (SGR e SMR – fig.14), onde observamos a presença do aminoácido leucina na posição 6 das amostras eluídas e a presença do aminoácido treonina na posição 4 das amostras subtraídas. Nas demais posições nada foi observado. Quando as amostras dos indivíduos CR foram analisados em conjunto (fig.18) a frequência das posições 4 e 6 se manteve, e apesar de alguns aminoácidos aparecem nesta análise em conjunto nas posições 1, 2, 7, 8 e 9
nenhuma frequência predominante foi observada. As demais posições não se alteraram.
Quando as análises são feitas com todos os peptídeos dos indivíduos OT, CR e HE ao mesmo tempo (fig.15), somente os fagos subtraídos OT, CR e HE (fig.20) ou somente os fagos eluídos de OT e CR (fig.19) a frequência de todas as posições é bastante randômica não podendo ser indicada nenhuma prevalência apesar da presença dos aminoácidos prolina e treonina em algumas posições.
Mesmo assim, com os resultados de phage display obtidos até o presente momento, podemos iniciar uma padronização de dados para posteriores análises computacionais. Nas tabelas 03 a 08 foram agrupadas informações quanto a composição de aminoácidos, ponto isoelétrico, presença de regiões potencialmente antigênicas, conformação e estrutura secundária dos peptídeos obtidos até o momento. Informações estas que podem ser utilizadas como entrada de dados em algoritmos de aprendizado de máquina ou rede neural que serão desenvolvidos e utilizados para a identificação de peptídeos ou grupos de peptídeos potencialmente diferenciais entre os grupos de pacientes. Este tipo de algoritmo preditivo já foi obtido com sucesso pelo nosso grupo para a diferenciação entre RNAs codificadores e não codificadores (Arrial e cols., 2009).
A titulação e sequenciamento do DNA dos fagos selecionados foi adaptada e padronizada a partir do protocolo fornecido pelo kit pH.D.12 Biolabs (# E8110S). Para tanto o primer de sequenciamento teve que ser modificado e re-desenhado para que se adequasse a plataforma de sequenciamento automático utilizada (Sanger), já que o primer fornecido pelo kit da Biolabs não amplificou a sequência com uma qualidade aceitável.
Para maiores análises dos resultados obtidos a partir dos peptídeos selecionados por phage display, há necessidade de obtenção de uma maior quantidade de sequências a partir de todos os grupos analisados. Somente a partir disso as análises matemáticas, estatísticas e comparativas poderão ser aplicadas dando maior confiabilidade aos nossos dados. Vale lembrar que sequenciar várias placas de uma mesma seleção ou obter mais clones de uma mesma seleção não é indicado pelo kit da biolabs. Dessa forma várias sequências poderiam se repetir e ainda assim isso não demonstra uma preferência de reconhecimento dos anticorpos utilizados, nem mesmo um perfil diferencial. Por isso o uso de uma nova tecnologia
de sequenciamento que gere uma maior quantidade de sequências em uma única seleção deve ser utilizada.