Resultados obtidos com o empacotamento binário

PARTE I

Na primeira parte do trabalho, realizaram-se três ensaios num leito de mistura binária com um empacotamento com uma fracção volúmica das partículas de maior dimensão de 0.7, uma razão das partículas de 0.1 e uma porosidade de

ε

= 0.217. Analisando, previamente, o gráfico obtido em A, B e C, apresentados no Apêndice F, evidencia-se uma grande semelhança entre os dois últimos. Partindo deste facto, calculou-se o valor médio da concentração de cada um dos microrganismos, ao longo do volume recolhido, para os ensaios B e C. O resultado é apresentado no gráfico da Figura 3.1.

0 5 10 15 20 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000 2 N º médi o de célu las ( ensa io B eC ) / m L v , mL 1

Figura 3.1. Gráfico que traduz a variação da concentração de 1 – Saccharomyces cerevisiae (●) e 2 – Lactobacillus bulgaricus (x) ao longo do volume recolhido no ensaio B e C da parte I.

A Figura 3.1. evidencia a presença de dois picos: um bem definido, simétrico e com boa resolução logo no início da separação (1) e outro com base alargada, também simétrico, para volumes maiores (2). O primeiro pico é relativo aos microrganismos circulares, o outro aos microrganismos lineares.

O diâmetro médio das leveduras, nesta fase, foi de 5.0 µm e o comprimento de bacilos 4.0 µm. Usou-se uma concentração de 2.575E+07 células/mL para as leveduras e 5.110E+07 células/mL para os bacilos

De acordo com vários estudos anteriormente efectuados neste laboratório, na área de filtração e separação, neste contexto, a forma celular tem um papel decisivo. Por este motivo, embora os bacilos possuam dimensões mais pequenas, a sua forma vai condicionar o movimento ao longo dos poros. Pelo contrário, as leveduras são favorecidas ao longo do processo, devendo conseguir “desembaraçar-se” do leito poroso mais rapidamente.

Uma primeira análise dos resultados pareceu indicar que, na verdade, a forma afecta fortemente a migração de microrganismos e as leveduras beneficiam da sua forma redonda. O processo de filtração e as variáveis que nele participam, contudo, tiveram de ser ajustados, sendo os resultados apresentados nas partes seguintes.

Nesta fase ainda, quando as leveduras eram observadas ao microscópio encontravam-se encontravam-separadas, no entanto, o aparecimento de gémulas era também muito comum e indeencontravam-sejado. Para solucionar este inconveniente, em vez de usar fermento de levedura instantâneo, passou-se a utilizar fermento de padeiro, e crescer as células em meio estéril YEPD, como foi indicado na secção “Materiais e Métodos”.

Outra das mudanças que ocorreu, e também apontada na secção 2.5., foi no processo de contagem celular. Nestes ensaios o apuramento foi feito recorrendo à câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer permite quantificar o número total de células por observação directa ao microscópio. Caracteriza-se por ser um método preciso. É, contudo, estatisticamente questionável, a menos que seja efectuado um grande número de observações. Além disso, por vezes, é também preocupante porque depende muito do local onde se retirou a amostra, do tratamento que esta sofreu (deve ser fortemente agitada para homogeneizar) e da sua injecção na câmara (devendo aguardar-se 1 minuto até proceder à contagem).

No caso em estudo, embora as células tenham uma morfologia distinta, pode também ter acontecido que os bacilos estivessem a ser captados de topo e serem contados como leveduras. No sentido de evitar esta dúvida, e avaliar melhor a dimensão e o contorno das células, estas passaram a ser coradas com cristal violeta durante poucos minutos.

Nos ensaios cujos resultados se irão apresentar de seguida a concentração celular de partida dos microrganismos passou a ser inferior. Uma concentração de células na ordem das dezenas de milhões por mililitro é um valor muito elevado e pode ter efeitos negativos como a acumulação de células nas esferas de vidro. Esta conclusão foi tirada depois de se ter calculado a percentagem de microrganismos que ficou retida no interior da coluna, valor este muito elevado.

PARTE II e III

As partes II e III referem-se às experiências efectuadas numa coluna de empacotamento binário. O empacotamento foi formado por uma mistura de esferas de vidro de 1.125 mm e 0.1115 mm, a uma fracção volúmica de tamanho maior de 0.7, tal como o empacotamento da

Na parte II filtraram-se Saccharomyces cerevisiae com diâmetro médio 4.47 µm e Lactobacillus bulgaricus de 6.80 µm de comprimento e 0.54 de diâmetro, com a concentração média de 2.8 E+06 células/mL.

Na parte III filtraram-se as microesferas verde – fluorescentes de poliestireno de 1 µm de diâmetro, tendo por comparação o comportamento do traçador azul dextrano.

Os resultados de cada um dos ensaios realizados estão descritos no Apêndice F – Observações Experimentais. Uma vez que se tornaria exaustiva a análise de cada um, acharam-se os valores médios e construiu-se o gráfico da Figura 3.2. No caso dos microrganismos os valores médios que são apresentados foram estimados conjuntamente com os valores obtidos na parte I.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 C^N v, mL 1 2 3

Figura 3.2. Resultados da separação das partículas: 1 – microesferas com concentração inicial média

C

₀ = 10.92 g/L (○), 2 – Saccharomyces cerevisiae com concentração inicial média

C

₀ = 0.358 g/L (●) e 3 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial média

C

₀ = 0.271 g/L (x), ao longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de concentração normalizada

C

_N que é igual à razão da concentração de um dado ponto com a concentração máxima. As curvas são uma aproximação da distribuição de Gauss.

Na observação da Figura 3.2. salientam-se, nitidamente, três picos de concentração normalizada. De acordo com a ordem de eluição o primeiro corresponde às microesferas, o segundo às leveduras e o terceiro aos bacilos. À partida, os resultados vão de encontro com aquilo que era esperado e que já foi, previamente, conseguido nos ensaios da parte I, ou seja, os microrganismos com a forma circular são favorecidos para estas condições de separação. Quando comparado o comportamento de separação partículas com forma idêntica, o volume tem um papel significativo, levando a melhor as microesferas, que têm um volume menor.

Tabela 3.1. – Características da separação das partículas no empacotamento binário: microesferas (○), Saccharomyces cerevisiae (●) e Lactobacillus bulgaricus (x), retiradas a partir da Figura 3.2.

Partículas Pico aos, mL

τ =t

_r

/ t

₀

λ

Microesferas (○) 8.0 0.870 0.017

Saccharomyces cerevisiae (●) 13.4 1.4; 1.456 0.078

Lactobacillus bulgaricus (x) 19.0 1.980 0.115 (0.009)

O tempo de retenção τ apresenta-se calculado com base na razão do tempo de eluição do pico de concentração da partícula filtrada com o tempo de eluição do marcador azul dextrano. A razão do tamanho da molécula com o tamanho do poro

λ

, no caso dos bacilos, é apresentada para as duas principais dimensões, correspondendo o valor entre parêntesis ao valor de

λ

calculado com o diâmetro destes microrganismos. Ao aumento do volume de eluição dos picos corresponde uma tendência crescente do tempo de retenção

τ

, pela seguinte ordem: microesferas (○), Saccharomyces cerevisiae (●) e Lactobacillus bulgaricus (x). Esta variação verifica-se também com a razão do tamanho da molécula com o tamanho do poro

λ

, considerando-se como dimensão principal o comprimento.

Apresentam-se, de seguida, as Figuras 3.3a. e 3.3b.

Figura 3.3a. Figura 3.3b.

Figura 3.3a. Resultados da separação de 1 – azul dextrano com concentração inicial

C

₀ = 1.0 g/L (■) e 2 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial

C

₀ = 0.333 g/L (x) ao longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de concentração normalizada

C

_N. As curvas são aproximações pela distribuição de Gauss.

Figura 3.3b. Resultados da separação de 1 – microesferas com concentração inicial

C

₀ = 10.92 g/L (○) e 2 – Lactobacillus bulgaricus com concentração inicial

C

₀ = 0.208 g/L (x) ao longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de

0 5 10 15 20 25 30 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2 C^N v, mL 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 2 C^N v, mL 1

No que diz respeito ao gráfico da Figura 3.3a. o traçador apresenta o pico de concentração normalizada aos 9.6 mL, enquanto para os bacilos esse pico é visível aos 20 mL pelo que

τ

= 2.08. No gráfico da Figura 3.3b. para as microesferas o pico é atingido aos 8.4 mL e

τ

= 0.913, para os bacilos obtém-se o pico aos 21.3 mL e

τ

= 2.315.

No caso da Figura 3.4. para o azul dextrano o pico verifica-se aos 9.2 mL e

τ

= 1. Para as microesferas o pico é atingido aos 8.1 mL e

τ

= 0.88.

Foi a partir dos gráficos das Figuras 3.3a., 3.3b. e 3.4. que se alcançaram os valores

0

t

do traçador utilizados para determinar

λ

na Tabela 3.1.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 C^N v mL 1 ₂

Figura 3.4. Resultados da separação de 1 – microesferas com concentração inicial

C

₀ = 10.92 g/L (○) e 2 – azul dextrano com concentração inicial

C

₀ = 1.0 g/L (■) ao longo do volume v, no empacotamento binário. Os dados estão representados na forma de concentração normalizada

N

C

. As curvas são aproximações pela distribuição de Gauss.

A observação das Figuras 3.3a. e 3.4. revela que o comportamento do azul dextrano é, ligeiramente diferente das outras partículas, nas mesmas condições conduzindo ao aparecimento de picos de base larga. Este facto faz com que haja um desvio do pico de azul dextrano da função Gaussiana e está relacionado, provavelmente, com o efeito de partição em zonas com regime de fluxo de estagnação.

A Figura 3.4. mostra ainda que o pico de eluição das microesferas(○) é inferior ao pico do azul dextrano(■). Esta não era uma situação esperada. Era previsto que o corante eluísse primeiro. Como foi apontado na secção “Materiais e Métodos” não existe um consenso, na literatura, relativamente ao tamanho das moléculas de dextrano, no entanto, pode-se estabelecer um valor médio de 63 nm. A ordem de grandeza em relação às microesferas e aos microrganismos é, portanto, de modo grosseiro, cerca de 10 vezes inferior.

No estudo de Rehmann et al. [5] é relatada uma situação idêntica, transpondo o caso das microesferas para vírus. Como os meios porosos tornam-se, crescentemente, heterogéneos (isto é, como 2

f

σ

aumenta, sendo 2 f

σ

a variância da gama de

ln.K

,

K

a condutividade hidráulica do meio), foi observado por estes autores que o transporte de um vírus pode ser facilitado a tal um grau que a chegada de vírus precede a chegada de um traçador. O aumento de 2

f

σ

implica uma quantia crescente de meios porosos pertencendo às caudas elevadas e baixas da distribuição

ln.K

, reflectindo a presença de canais com maior e menor condutividade. A interpretação deste resultado é que são excluídos vírus das regiões de baixa condutividade por causa dos tamanhos restritivos dos poros em materiais finamente granulados, relativamente ao diâmetro do colóide (por exemplo, são excluídos vírus de certas argilas e da porosidade interna – intra-grânulos) mas eles são capazes de se moverem pelas bandas de condutividade maiores, que são caracterizadas por velocidades de fluxo pelo poro mais altas. Assim, o aumento do grau de heterogeneidade resulta numa inovação mais rápida do transporte de vírus pelos meios até ao topo mais elevado da distribuição

ln.K

.

Pode-se supor que, tal como aquilo que se passa com os vírus, as microesferas, em condições menos favoráveis ao seu movimento, acabam também por ser excluídas deslocando-se para zonas de maior condutividade onde são mais facilmente transportadas.

Relativamente às partes I e II é preciso ainda acrescentar que há uma diferença notória entre os volumes de eluição determinados para os microrganismos Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus bulgaricus. Na primeira parte obtiveram-se os picos de concentração a 2.5 mL para as células de fermento e 12.8 mL para os bacilos, enquanto na parte II esses valores foram de 13.4 mL e 19.0 mL. Em termos gráficos, na segunda parte, houve um deslocamento de ambos para a direita. Podem ser enunciadas algumas razões que tenham levado a esta mudança, como por exemplo, a existência de canais preferenciais no primeiro empacotamento. Contudo, foram vários os parâmetros mudados na segunda parte: a concentração das soluções empregue, a forma como esta foi medida, entre outras, que tornam difícil descobrir a verdadeira razão. Note-se que todas as alterações entre a parte I e II visaram optimizar e tornar mais credíveis os resultados obtidos.

3.2 Resultados obtidos com os empacotamentos com

No documento Cortez, Susana Separação selectiva de microrganismos por filtração anisotrópica (páginas 52-57)