A Figura 9 demonstra os resultados da análise eletroforética dos extratos salinos por SDS-PAGE em gel a 12% corado pelo nitrato de prata, ilustrando os diversos peptídeos nos quatro extratos antigênicos.
M 1 2 3 4
Figura 9 – O perfil eletroforético dos quatro extratos antigênicos de metacestódeos de T.
solium por SDS-PAGE em gel 12% corado por nitrato de prata. Linhas: M) marcador de peso moleculare; 1) Distrito Federal; 2) Bahia; 3) Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito-MG e 4) São Paulo. kDa 116 97 84 66 55 45 30 29 24 14
As amostras de soro de 98 indivíduos, sendo 49 do Grupo 1, 39 do Grupo 2 e 10 do Grupo 3, foram analisadas por WB frente aos peptídeos antigênicos presentes nos extratos salinos totais de metacestódeos de T. solium. As Figuras 10, 11, 12 e 13 demonstram os marcadores de pesos moleculares reconhecidos pelos anticorpos IgG anti-metacestódeo de T. solium pelo WB, nas amostras de soro dos indivíduos do Grupo 1, NC ativa e inativa, Grupo 2 e Grupo 3; frente ao extrato salino do DF, BA, RM-MG e SP, respectivamente.
A Figura 14 apresenta as freqüências de reconhecimento de bandas pelos anticorpos presentes nas amostras de soro dos indivíduos frente aos extratos salinos do DF, BA, RM-MG e SP nas amostras séricas de pacientes do Grupo1, com NC ativa (A) e inativa (B). As amostras de pacientes com NC ativa reconheceram o total de 12 peptídeos antigênicos, sendo que os pesos moleculares de 18, 24, 28-32, 39-40, 47-52, 64-68, 70, 80, 86, 95, 98 e 116 kDa foram reconhecidos no extrato salino de metacestódeos do DF. As bandas de 24, 47-52, 64-68, 70, 86 e de 95 kDa foram reconhecidas no extrato da BA. Os pesos moleculares aparentes de 24, 28-32, 39-42, 64-68, 70, 80, 86 e 116 kDa foram reativos no extrato de RM-MG. As bandas de 28-32, 47-52, 64-68, 80 e 86 kDa foram reconhecidas no extrato de SP.
O peptídeo de peso molecular aparente de 64-68 kDa foi reconhecido, exclusivamente, nas amostras séricas de pacientes com NC ativa nos quatro extratos salinos analisados (p=0,001); sendo que a freqüência de reconhecimento desse peptídeo foi de 57,89%, 79%, 89,5% e 89,5% nos extratos salinos do DF, BA, RM-MG e SP, respectivamente. Observou-se que no extrato DF, a reatividade da banda 64-68 kDa foi significativamente inferior em relação aos extratos do RM-MG e de SP (p=0,02); e as bandas de 24 e de 28-32 kDa apresentaram reconhecimento. A banda de 28-32 kDa apresentou freqüência de reconhecimento de 26,3%; 0%; 31,6% e de 36,84 % nos
extratos salinos do DF, BA, RM-MG e SP, respectivamente; sendo que foi significativamente mais elevada a freqüência de reconhecimento dessa banda nos extratos de RM-MG (p=0,01) e SP (p=0,03) em relação ao extrato da BA.
As amostras de soro dos 30 pacientes do grupo 1, com NC inativa, reconheceram, predominantemente, as bandas antigênicas de pesos moleculares de 86 kDa; 86 e 95 kDa; 86 kDa; 80 e 86 kDa nos extratos salinos do DF, BA, RM-MG e SP, respectivamente. Essas bandas apresentaram elevadas freqüências de reconhecimento em todas as amostras e, portanto foram consideradas inespecíficas para o diagnóstico de NC.
As amostras de soro dos 39 indivíduos do grupo 2 que foram analisadas pelo WB demonstraram diferenças significativas no reconhecimento de peptídeos antigênicos nos diferentes extratos analisados. As amostras dos pacientes com hidatidose foram as mais reativas (p=0,001) e reconheceram os peptídeos (22, 28, 38, 35, 40, 45, 50, 60, 68, 77, 86, 95 e 116 kDa) nos extratos analisados. Sendo que os peptídeos de 68 e 77 kDa apresentaram freqüência de reconhecimento superior nos quatro extratos em relação as demais infecções helmínticas (p<0,05). No entanto, essas bandas não foram relacionadas ao critério de positividade adotado no WB, e nenhuma amostra de soro de paciente com hidatidose reconheceu o marcador de 64-68 kDa.
Dentre as dez amostras de soro dos indivíduos do Grupo 3 que foram analisadas pelo WB, somente cinco reconheceram bandas antigênicas, que apresentaram pesos moleculares de 86 kDa; 86 e 95 kDa; 86 kDa; 80 e 86 kDa nos extratos salinos do DF, BA, RM-MG e SP, respectivamente.
A comparação da reatividade de anticorpos IgG anti-T. solium presentes em amostras séricas de indivíduos dos Grupos 1, 2 e 3 frente aos extratos salinos totais analisados nos testes ELISA e WB está demonstrada na Tabela 6. Os anticorpos IgG anti-metacestódeos de T. solium apresentaram reatividade cruzada com hidatidose no
ELISA, sendo reativos em 90% das amostras analisadas no extrato do DF e de 70% nos demais extratos. O WB apresentou especificidade superior ao ELISA e no Grupo 1 o critério de positividade adotado permitiu distinguir as formas ativa e inativa da NC.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e c o n h e c im e n to p o r a n ti c o rp o s I g G ( % ) 18 24 28-32 39-42 47-52 64-68 70 80 86 95 98 116
marcadores antigênicos (kDa)
DF BA RM-MG SP 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e c o n h e c im e n to p o r a n ti c o rp o s I g G ( % ) 18 24 28-32 39-42 47-52 64-68 70 80 86 95 98 116
marcadores antigênicos (kDa)
Figura 14 – Freqüência de marcadores antigênicos reconhecidos pelos anticorpos IgG anti-T.
solium presentes nas amostras de soro de pacientes com neurocisticercose (NC), diluídas 1:50, pelo “Western Blotting” frente aos extratos salinos de metacestódeos provenientes de diferentes áreas geográficas do Brasil: Distrito Federal (DF), Bahia (BA), Rio Mosquito (MG) e São Paulo (SP). A) 19 pacientes com NC ativa e B) 30 pacientes com NC inativa. (*, **, #): Diferenças estatísticas significante entre duas proporções p < 0,05 nas freqüências das bandas em relação aos extratos.
A B * ** # * **
5. DISCUSSÃO
Nesse estudo, a presença de polimorfismo no DNA de T. solium e a reatividade de anticorpos IgG, em amostras séricas de pacientes com NC e controles, frente aos extratos salinos de populações de metacestódeos provenientes de diferentes áreas geográficas, foram analisados pela primeira vez no Brasil.
A tecnologia da RAPD tem sido uma eficiente ferramenta no estudo da variabilidade genética intra-específica de diferentes espécies. Recentemente, foram comparadas as metodologias da RAPD, AFLP (“amplified fragment length polymorphism”) e SSR (“simple sequence repeats”) derivadas do PCR na caracterização de 27 linhagens de Saccharomyces cerevisiae, demonstrando que todas apresentaram resolução suficiente para detectar diferenças genéticas entre as linhagens desse organismo (GALLEGO et al., 2005).
As pesquisas sobre variabilidade genética em T. solium têm sido inferiores em número quando comparadas com numerosas investigações em E. granulosus, agente etiológico da hidatidose, mesmo assim estudos demonstraram variabilidade intra- específica em T. solium (NAKAO et al., 2002; GONZALEZ et al., 2002; VEGA et al., 2003; YAMASAKI et al., 2004).
Em nosso estudo foi possível distinguir as cinco populações de metacestódeos de T. solium com seis “primers” e dois deles foram suficientes na distinção dessas populações. O “primer” 26 (GGGTTTGGCA) diferenciou as populações RM-MG e UB-MG, e o 29 (TCGCCAGCCA) diferenciou as populações de DF, BA, SP e UB-MG entre si. Resultados semelhantes foram obtidos em estudo de variabilidade genética em metacestódeos de T. solium, dissecados de suínos originários de três regiões do México, Honduras e Tanzânia, que demonstraram 88% de polimorfismo por RAPD em metacestódeos de T. solium (MARAVILLA et al., 2003b).
As distâncias genéticas verificadas nesse estudo sugerem que as amostras analisadas apresentaram diferenciação intra-específica. Esses resultados evidenciaram quatro grupos distintos, sendo um grupo constituído pelos metacestódeos das áreas da Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito (RM-MG) e de São Paulo (SP), que apresentaram maior semelhança entre si, embora essas populações se localizem em áreas distantes a 1.200 km. O segundo agrupamento engloba a população de metacestódeos de T.
solium da área de Uberaba, Minas Gerais (UB-MG); essa amostra foi obtida de hospedeiro humano e apresentou 18% de distância genética em relação às amostras de RM-MG e SP. O terceiro grupo inclui os metacestódeos da Bahia (BA); e o último reúne a população de
T. solium do Distrito Federal (DF); esses dois grupos apresentaram 1,5% de distância genética entre si e a maior diferenciação genética em relação às demais amostras. A semelhança genética dentro de cada grupo de isolados, provavelmente relaciona-se com migração humana e o comércio de suínos entre essas áreas conforme Vega et al. (2003).
As correntes migratórias humanas no Brasil são freqüentes, as pessoas migram em busca de trabalho e melhores condições de sobrevivência. Nas décadas de 80 e 90, foram freqüentes as migrações de indivíduos provenientes de cidades ou meio rural da região Nordeste para os centros urbanos da região Sudeste, principalmente para o Estado de São Paulo (WIKIPÉDIA, 2006), fato que provavelmente relaciona-se com o maior fluxo gênico entre parasitos. A criação de suínos para subsistência, em geral, em instalações precárias de higiene no peridomicílio, é freqüente nos municípios brasileiros e constitui fator de risco associado à transmissão da teníase por T. solium e de cisticercose humana (VIANNA et al., 1986; BIONDI et al., 1996).
A migração de pessoas e o comércio de suínos foram associados como fatores que interferem no aparecimento de NC em novas áreas e permitem o fluxo de variedades genéticas do parasito (DEKUMYOY et al., 2004). Estudo desenvolvido no
México demonstrou que o comércio de suínos foi mais ativo entre regiões próximas às zonas rurais do que entre povoados distantes e houve maior trânsito de pessoas portadoras de T. solium entre cidades vizinhas conforme demonstrado por Vega et al. (2003). Esses resultados diferiram dos dados obtidos nessa tese, em que as populações com maior semelhança foram as que apresentaram distância geográfica considerável entre si.
As distâncias geográficas podem atuar como barreiras que permitem o isolamento genético entre seres vivos da mesma espécie, fato não significante entre as populações de RM-MG e SP, pois essas distantes 1.200 km, apresentaram menor variabilidade genética entre si, provavelmente devido aos elevados níveis de migração humana no nosso país. Resultados semelhantes foram demonstrados em estudo de diferenças raciais na espécie humana, que analisou a distância genética para “loci” de proteínas entre as populações européia, asiática e africana do sub-Saara, demonstrando maior distância genética entre as populações locais. As populações de continentes diferentes apresentaram variabilidade genética consideravelmente pequena para a classificação de sub-espécies ou raças humanas (COSMIDES et al., 2003). A diferenciação genética entre indivíduos de uma mesma área geográfica pode ocorrer devido às pressões seletivas do ambiente, que nesse caso constitui o organismo do hospedeiro sobre o parasito.
Em relação aos pacientes com NC (Grupo1), cujas amostras séricas foram analisadas nesse estudo, verificou-se predominância de pacientes do sexo feminino e idade média de 42 anos. Na literatura há diferentes prevalências de NC em relação ao sexo do hospedeiro. A predominância de indivíduos do sexo masculino (58,2%) com NC foi evidenciada em estudo prospectivo de 55 pacientes com diagnóstico de NC e a média de idade de 42 anos (variando entre 15 e 72 anos), residentes no estado de São Paulo (MACHADO et al., 2002). Em uma avaliação de 45 pacientes chineses com diagnóstico
comprovado de NC, Ikejima et al. (2005) não demonstraram diferença estatisticamente significante na predominância da infecção entre os indivíduos do sexo masculino e feminino. A média de idade dos pacientes com NC sintomática demonstrada nesse estudo apresenta concordância com pesquisas nacionais e internacionais (AGAPEJEV, 2003; GARCIA, DEL BRUTTO, 2005). Em algumas helmintíases, como em esquistossomose mansônica observa-se prevalência da infecção em relação ao sexo; no entanto, na NC humana esse fato não está estabelecido (SCIUTTO et al., 2000).
Os testes imunológicos utilizados nesse estudo, demonstraram diferenças de reatividade de anticorpos IgG presentes nas amostras séricas de pacientes com NC em relação aos extratos antigênicos das quatro populações de metacestódeos de T.
solium analisadas. As amostras de soros de pacientes com NC apresentaram índice de reatividade pelo ELISA mais elevado do que os demais grupos. A diferença estatisticamente significante na freqüência de positividade de amostras séricas de pacientes com NC foi demonstrada no extrato antigênico do DF, em relação aos demais extratos analisados. As diferenças de infectividade e patogenicidade da infecção por metacestódeos de T. solium, manifestam-se na diferença de reconhecimeno de antígenos do parasito pelos anticorpos do hospedeiro humano e relacionam-se, provavelmente com a variabilidade genética do parasito (CAMPBELL et al., 2006). Aliado as condições sanitárias rurais, predominantemente desfavoráveis, dos países em desenvolvimento que são preponderantes na propagação do agente parasitário, além de intensificar a evolução progressiva da diferenciação e variabilidade genéticas de T. solium, resultando em heterogeneidade clínica, patológica e imunológica da doença (VEGA et al., 2003).
A positividade do teste ELISA em amostras de soro de pacientes com outras helmintíases foi demonstrada, especialmente em amostras de indivíduos com diagnóstico de hidatidose. Este fato é freqüente, no entanto o teste ELISA constitui a
melhor escolha para a triagem de pacientes provenientes de áreas onde a cisticercose é endêmica (ITO, 2002). A reação cruzada observada nesse trabalho pode ser explicada pela proximidade filogenética entre os parasitos, que apresentam proteínas antigênicas semelhantes, visto que T. solium pertence ao Filo Plathyhelmintes que inclui S. mansoni, agente etiológico da esquistossomose mansônica, na Classe Cestoidea que inclui, também,
H. nana, responsável pela himenolepíase e na Família Taeniidae na qual está classificada a espécie de E. granulosus (REY, 2001; HOBERG, 2006). A teníase, no Brasil, apresenta T.
solium e T. saginata como agentes etiológicos, sendo que os pacientes com essa infecção, cujas amostras de soro foram avaliadas, apresentaram reatividade cruzada menor em relação a hidatidose. Esse fato pode estar relacionado à detecção de antígenos estágios específicos do parasito (HOBERG, 2006).
De acordo com outras pesquisas o diagnóstico sorológico da NC é influenciado pelos níveis de anticorpos produzidos durante a infecção (DEKUMYOY et al., 2004) e apresenta reatividade cruzada com outras infecções, principalmente com a hidatidose, teníase e himenolepíase (SCIUTTO et al., 2000: GARCIA, DEL BRUTTO, 2005).
Os pacientes com NC inativa apresentaram reatividade sorológica elevada pelo ELISA, resultados que confirmam a identificação da presença de anticorpos em amostras de soro refletem a infecção, atual ou passada e não apenas em sua apresentação neurológica. Os pacientes com cisticercose muscular ou subcutânea podem, também, apresentar resultado positivo pelo ELISA (DEL BRUTTO et al, 2001; FERRER et al., 2005). O poliparasitismo de indivíduos por helmintos constitui achado freqüente em países em desenvolvimento e apresenta forte associação com a reatividade sorológica cruzada no diagnóstico da cisticercose (FLISSER, 2006). A hidatidose é endêmica na região Sul do Brasil. Uma pesquisa desenvolvida nessa região, analisou 127 amostras de
soro de pacientes com helmintíases na detecção de anticorpos IgG frente a diferentes antígenos e foi demonstrada reatividade cruzada em amostras séricas de pacientes com esquistossomose e hidatidose pelo teste ELISA, frente ao extrato antigênico de líquido de vesícula de metacestódeos de T. solium (ISHIDA et al., 2003). A detecção sorológica de anticorpos anti-metacestódeos de T. solium em amostras de soro e LCR de pacientes mexicanos com NC e de indivíduos com outras parasitose provenientes de diferentes países foi avaliada por Gekeler et al. (2002) que demonstraram sensibilidade de 75% e 83% em amostras de soro e LCR, respectivamente. A reatividade cruzada foi verificada em 54% dos 26 pacientes com hidatidose, 19% dos 16 indivíduos com estrongiloidíase e 14% de sete pessoas com esquistossomose no ELISA (GEKELER et al., 2002).
Em estudo de reatividade de IgG pelo ELISA, utilizando antígenos de metacestódeos de T. solium, em amostras séricas de grupos de pacientes com infecções por helmintos, protozoários ou vírus demonstraram reconhecimento de anticorpos em 17/20 de amostras de soro de pacientes com hidatidose; 5/13 amostras de pacientes com esquistossomose e 1/2 pacientes com himenolepíase (FERRER et al., 2005).
Os resultados do teste WB foram interpretados, nesse estudo, de acordo com o critério de reatividade de bandas antigênicas descrito por Shiguekawa et al. (2000) e utilizado por outros autores (OLIVEIRA et al., 2006). O reconhecimento do marcador antigênico de peso molecular de 64-68 kDa foi exclusivo e imunodominate em amostras séricas de pacientes com NC ativa; resultado semelhante foi obtido por Oliveira et al. (2006). Esse peptídeo foi demonstrado por Barcelos et al. (2001) com freqüência de reatividade imunodominante frente a anticorpos IgG presentes em amostras de LCR de pacientes com NC. O marcador antigênico de 65-70 kDa foi demonstrado por Simac et al. (1995) com freqüência de reconhecimento em amostras de LCR de pacientes com NC provenientes de uma ilha “La Réunion” localizada no Oceano Indico. A utilização de um
critério específico na análise dos marcadores antigênicos pelo WB permite o diagnóstico da cisticercose em amostras de soro de pacientes residentes em áreas onde essa doença é endêmica (PAWLOWSKI, ALLAN, SARTI, 2005). O WB apresentou elevadas sensibilidade e especificidade, no diagnóstico da cisticercose humana frente aos extratos salinos totais de diferentes populações de metacestódeos de T. solium.
No presente trabalho, o WB apresentou níveis de especificidade compatíveis com o EITB, pois as bandas reconhecidas nas amostras de indivíduos do grupo com outras helmintíases não foram relacionadas à positividade. O EITB foi descrito por Tsang, Brand, Boyer (1989) e utiliza sete glicoproteínas (de 13 a 50 kDa) de metacestódeos de T. solium, com especificidade de 100% em amostras de soro de indivíduos provenientes de áreas onde a cisticercose é endêmica. Em nosso estudo, as bandas de baixo peso molecular, que foram reconhecidas pelos anticorpos séricos apresentaram pesos moleculares de 18, 24, 28-32, 39-42 e 47-52 kDa, sendo que a banda de 28-32 kDa foi, significativamente, reconhecida nos extratos de RM-MG e de SP. As bandas de 8 e de 26 kDa foram descritas como específicas no diagnóstico sorológico da NC em amostras de soro e de LCR por Gottstein, Tsang e Schantz (1986).
Os marcadores de pesos moleculares de 80, 86, 95 e 98 kDa foram considerados inespecíficos para o diagnóstico da NC humana nesse estudo. A banda de 80 kDa, segundo Shiguekawa et al. (2000), constitui marcador que apresenta elevados índices de reatividade cruzada com outros parasitos. As bandas de 95 e de 98 kDa foram relacionadas ao antígeno B e à paramiosina, respectivamente, os quais são peptídeos altamente conservados nos cestodas (LARRALDE et al., 1990; SCIUTTO et al., 2000).
Os resultados obtidos nesse estudo contribuem para acrescentar dados à genética do parasito e, possivelmente, para a compreensão da heterogeneidade da sintomatologia que os pacientes com neurocisticercose (NC) apresentam.
6. CONCLUSÕES
- Os metacestódeos de T. solium provenientes de diferentes áreas geográficas do Brasil analisados nesse estudo apresentaram polimorfismo por marcadores RAPD;
- As freqüências de reatividade de anticorpos IgG anti-T. solium detectadas em amostras de soro de pacientes com neurocisticercose apresentaram diferença significativa no extrato do DF em relação aos demais extratos salinos de metacestódeos provenientes de diferentes áreas geográficas do Brasil;
- A freqüência e quantidade de marcadores antigênicos reconhecidos pelos anticorpos IgG presentes em amostras de soro de indivíduos com neurocisticercose apresentaram diferenças significativas nos extratos salinos analisados
- As populações de T. solium analisadas nesse estudo apresentaram variabilidade genética e diferenças de antigenicidade.