A análise histológica dos músculos tibial anterior (TA) mostrou uma redução da área de secção transversa das fibras musculares dos grupos MLC/SOD controle (MLC/SOD K) comparados ao controle wild type (WT K) observadas pelas colorações de hematoxilina e eosina (Fig. 1) e tricômio de Masson (Fig. 2). Após 2 dias de lesão pela cardiotoxina, podemos observar uma grande área de necrose (Fig. 1, 2 e 3) tanto nos grupos wild type quando nos transgênicos MLC/SOD. No 5º dia pós-lesão em wild type (WT 5d) e MLC/SOD 5d observamos uma proliferação de tecido conjuntivo (Fig. 1 e 2) e algumas poucas fibras necróticas (Fig. 3). Contudo, no 10º dia pós-lesão notamos um acúmulo de tecido conjuntivo nos músculos transgênicos com várias pequenas fibras musculares com núcleos centralizados, mas com um padrão arquitetônico ainda desorganizado se comparadas a wild type 10d (Fig. 1 e 2). Não foram observadas fibras necróticas em 10 dias para wild type e MLC/SOD (Fig. 3).
A análise protéica dos músculos quadríceps transgênicos lesados mostrou um atraso na expressão de fatores de ativação de células satélites como Pax7 (Fig. 4), desmina (Fig. 5) e myoD (Fig. 6) comparado aos músculos wild type lesados. Além disso, a miogenina, que é um importante fator de diferenciação de mioblastos também apresentou um retardo de expressão nos músculos transgênicos lesados comparado aos normais lesados (Fig. 7).
FIGURA 1: Cortes histológicos transversais de músculos tibial anterior (TA) de camundongos wild type (normais) e MLC/SOD
corados com hematoxilina e eosina. Os músculos foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão por cardiotoxina. Na porção superior da figura estão apresentados os animais wild type controle (K), 2 dias, 5 dias e 10 dias pós-lesão respectivamente. Abaixo a mesma ordem dos animais MLC/SOD. Note que as fibras musculares do grupo MLC/SOD K apresentam menor área de seção transversa se comparado ao wild type K. Não foram observadas diferenças significativas entre os animais wild type e MLC/SOD 2 e 5 dias após lesão. Note a presença de fibras com lesão de membrana 2 dias pós lesão e o aumento no infiltrado inflamatório no 5º dia. No 10º dia pós lesão os animais MLC/SOD mostraram um aumento significativo da proliferação de tecido conjuntivo comparado a wild type 10d.
FIGURA 2: Cortes histológicos transversais de músculos tibial anterior (TA) de camundongos wild type (normais) e MLC/SOD
corados com tricômio de Masson. Os músculos foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão por cardiotoxina. Na porção superior da figura estão apresentados os animais wild type controle (K), 2 dias, 5 dias e 10 dias pós-lesão respectivamente. Abaixo a mesma ordem dos animais MLC/SOD. Observe um aumento da deposição de colágeno no 10º dia pós-lesão nos animais MLC/SOD comparado aos músculos wild type 10 dias.
FIGURA 3: Cortes histológicos transversais de músculos tibial anterior (TA) de camundongos wild type (normais) e MLC/SOD
submetidos ao azul de Evans (marcação de fibras necróticas) e hoechst (marcação de núcleos). Os músculos foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão por cardiotoxina. Na porção superior da figura estão apresentados os animais wild type controle (K), 2 dias, 5 dias e 10 dias pós-lesão respectivamente. Abaixo a mesma ordem dos animais MLC/SOD. Não foram observadas diferenças significativas no número e padrão das fibras necróticas pós-lesão entre os grupos.
FIGURA 4: Níveis de proteína de Pax7 em músculos quadríceps (TH) avaliados por
Western blot e quantificados por densitometria de camundongos selvagens/wild type (normal) e MLC/SOD (transgênicos). Os músculos TH direitos (lesados) e esquerdos (controle contra-lateral) dos grupos wild type e MLC/SOD foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão. Na porção superior da figura está apresentado o blot e na parte inferior a representação gráfica da avaliação densitométrica. Observe um atraso na expressão de Pax7 no grupo MLC/SOD comparado ao wild type.
FIGURA 5: Níveis de proteína de desmina em músculos quadríceps (TH) avaliados por
Western blot e quantificados por densitometria de camundongos selvagens/wild type (normal) e MLC/SOD (transgênicos). Os músculos TH direitos (lesados) e esquerdos (controle contra-lateral) dos grupos wild type e MLC/SOD foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão. Na porção superior da figura está apresentado o blot e na parte inferior a representação gráfica da avaliação densitométrica. Observe um atraso na expressão de desmina no grupo MLC/SOD comparado ao wild type.
FIGURA 6: Níveis de proteína de myoD em músculos quadríceps (TH) avaliados por
Western blot e quantificados por densitometria de camundongos selvagens/wild type (normal) e MLC/SOD (transgênicos). Os músculos TH direitos (lesados) e esquerdos (controle contra-lateral) dos grupos wild type e MLC/SOD foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão. Na porção superior da figura está apresentado o blot e na parte inferior a representação gráfica da avaliação densitométrica. Observe um atraso na expressão de myoD no grupo MLC/SOD comparado ao wild type.
FIGURA 7: Níveis de proteína de miogenina em músculos quadríceps (TH) avaliados
por Western blot e quantificados por densitometria de camundongos selvagens/wild type (normal) e MLC/SOD (transgênicos). Os músculos TH direitos (lesados) e esquerdos (controle contra-lateral) dos grupos wild type e MLC/SOD foram avaliados 2, 5 e 10 dias pós-lesão. Na porção superior da figura está apresentado o blot e na parte inferior a representação gráfica da avaliação densitométrica. Observe um atraso na expressão de miogenina no grupo MLC/SOD comparado ao wild type.
Neste estudo em que realizamos em colaboração com o Prof. Antonio Musarò observamos que marcadores moleculares envolvidos com a ativação de células satélites (Pax7, desmina e myoD) e na diferenciação dos mioblastos (como a miogenina) apresentavam um atraso na sua expressão nos músculos transgênicos MLC/SOD1 comparados ao processo normal de reparo. Além disso, análises histológicas mostraram um aumento de tecido conjuntivo no 10 dias pós-lesão por cardiotoxina comparado a animais normais também com lesão.
Os resultados deste estudo abrem novas perspectivas para o entendimento e a caracterização deste processo de reparo além de propor generalizações para outras situações em que ocorre o aumento do estresse oxidativo no músculo como no envelhecimento (Conboy et al., 2003). Avançar sobre o conhecimento deste processo adaptativo muscular permitirá traçar estratégias terapêuticas para tornar a regeneração muscular mais eficiente ou mesmo acelerá-la em situações em que o estresse oxidativo está aumentado no músculo.
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