3.1. Observações no campo
Os resultados das visitas ao campo encontram-se sumarizadas na tabela 2. De modo geral, pode-se observar que uredosporos ocorreram durante todo o ano e eciosporos e teliosporos ocorreram durante a estação quente e fria, respectivamente. O comportamento de P. tuberculatum no ano 2000 foi diferente, observando-se uma virtual ausência de teliosporos na época esperada e a ocorrência, apesar de pequena, deste estádio no verão. A escassez de teliosporos ao longo de 2000 foi uma importante limitação para a execução dos estudos citológicos previstos.
3.2. Inoculações controladas
3.2.1. Efeito da luz na esporulação de Prospodium. tuberculatum
Vinte e três dias após a inoculação observou-se que as plantas mantidas no escuro mostraram esporulação bem mais abundante e com maior número de pústulas, sendo que nestas plantas houve esporulação em ambos os lados das folhas, o que não foi observado nas plantas mantidas sob fotoperíodo de 16 horas.
3.2.2. Produção de teliosporos
Não foi observada produção de teliosporos em qualquer dos tratamentos, porém as plantas sujeitas ao estresse térmico mostraram esporulação mais abundante e ocasional desfolha devido à severidade das lesões foliares.
Tabela 2- Observações da ocorrência natural de fungos causadores de ferrugem em L. camara.
DATA FUNGO LOCAL OBSERVAÇÃO
15/06/97 Prospodium tuberculatum São Miguel do Anta (SMA)
Teliosporos nas duas faces das folhas
24/06/97 P. tuberculatum SMA Abundância de teliosporos 22/08/97 P. tuberculatum SMA Uredosporos e teliosporos 12/12/97 P. tuberculatum SMA Apenas de uredosporos 12/03/98 Aecidium lantanae Frade Presença de eciosporos
25/03/98 P. tuberculatum SMA Uredosporos
27/04/98 P. tuberculatum SMA Uredosporos
12/06/98 P. tuberculatum SMA Uredosporos
28/06/98 P. tuberculatum SMA Uredosporos e teliosporos
14/07/98 P. tuberculatum SMA Teliosporos
17/07/98 P. tuberculatum SMA Teliosporos
24/07/98 P. tuberculatum Frade Uredosporos e teliosporos
21/08/98 P. tuberculatum SMA Uredosporos
24/11/98 A. lantanae/ P. tuberculatum Frade/ SMA Eciosporos e uredosporos
10/07/99 P. tuberculatum SMA Teliosporos
13/04/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
02/05/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
24/05/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
25/06/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
12/07/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
25/07/00 P. tuberculatum SMA Duas folhas com teliosporos 09/08/00 P. tuberculatum SMA Ausência de teliosporos 22/09/00 P. tuberculatum Curitiba Ausência de esporos 26/09/00 P. tuberculatum São Paulo Ausência de esporos
29/09/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
17/10/00 P. tuberculatum Viçosa
(Zootecnia/UFV)
Uredosporos
24/10/00 P. tuberculatum Viçosa (Pomar/ UFV) Teliosporos em uma folha
27/10/00 P. tuberculatum SMA Uredosporos
27/10/00 P.tuberculatum Viçosa (Pomar/ UFV) Apenas uredosporos
3.3. Germinação de teliosporos
Nos tratamentos com peróxido de hidrogênio e hipoclorito de sódio, não houve germinação dos teliosporos durante o período de observação. Já nos dois experimentos em que se avaliaram a influência de diferentes temperaturas, a germinação dos teliosporos foi observada. No primeiro ensaio observou-se ocorrência de germinação após 24 horas, apenas a 15 e 20oC. No segundo ensaio, apenas após 24 horas, iniciou-se tanto a germinação dos teliosporos quanto a ejeção dos basidiosporos (Tabela 3). Segundo os
experimentos realizados, 15oC foi a melhor temperatura para germinação de teliosporos.
Tabela 3- Germinação de teliosporos e ejeção de basidiosporos de Prospodium
tuberculatum em diferentes temperaturas.
TEMPERATURA (oC) TELIOSPOROS BASIDIOSPOROS R1 R2 R3 R1 R2 R3 10 N S S N N N 15 S S S S S S 16 N S N N S S 19 S N S N N N 22 N S N N N N
S= esporos germinados/ basidiosporos ejetados; N= esporos não germinados/ basidiosporos não ejetados
3.4. Método e tempo de armazenamento na germinação de teliosporos
Observou-se queda generalizada na germinação dos teliosporos do fungo independente do método utilizado. A germinação dos esporos frescos que variava entre 20 e 30%, após o armazenamento, em ambos os tratamentos utilizados, caiu para 5% após 30 dias, mantendo esta porcentagem até os 60 dias e atingindo apenas 1% aos 90 dias.
3.5. Inoculação de Lantana camara com basidiosporos de Prospodium tuberculatum
Embora tenha sido observada germinação dos teliosporos em todas as placas de Petri contendo ADA, não foi obtida infecção das plantas em nenhum dos ensaios, após 21 dias da inoculação. As amostras de folhas submetidas à
coloração e clareamento mostraram eventuais teliosporos em início de germinação sobre as folhas, porém não foram observados basidiosporos.
3.6. Conexão entre Aecidium lantanae e Prospodium tuberculatum
3.6.1. Inoculações controladas
Não foi observada produção de quaisquer sintomas, em nenhuma das plantas inoculadas, seja com eciosporos de A. lantanae ou com teliosporos de
P. tuberculatum.
3.6.2. Estudos moleculares
Apesar do par de primers ITS1-F e ITS4-B permitir uma amplificação mais específica que os demais testados, já que foram observadas apenas bandas referentes aos fungos e não do material vegetal, os resultados não demonstraram ser repetitivos, e em numerosas reações amplificadas não foi possível visualizar bandas, que apareciam como um arraste, ou simplesmente ausência de bandas. Ao contrário, o par de primers ITS1 e ITS4 mesmo amplificando material vegetal, o qual foi facilmente reconhecido como distinto das bandas apresentadas pelo material fúngico, foi o mais indicado para o presente trabalho, pela repetitividade dos resultados.
Uma indicação clara de que amostras de uredosporos e teliosporo de P.
tuberculatum são geneticamente diferentes de eciosporos de A. lantanae foi
obtida a partir da visualização de bandas com diferentes tamanhos, situadas entre 506 e 1018 pares de bases (Figura 2). Uredosporos de P. tuberculatum apresentaram o mesmo tamanho de banda, assim como a amostra de teliosporo do mesmo fungo, independente do local de coleta, demonstrando tratar-se do mesmo fungo. Também as amostras referentes a A. lantanae procedentes de diversos locais, mostraram a similaridade genética desta espécie. O DNA
amplificado das amostras de A. lantanae apresentou o tamanho mais próximo de espécies do gênero Puccinia (Figura 3).
Figura 2- Amplificação da região ITS de diferentes espécies, utilizando-se o par de primers ITS1 e ITS4. M- Marcador Kb DNA, A- uredosporos de Prospodium tuberculatum, Frade, RJ; B- uredosporos de P.
tuberculatum, São Miguel do Anta, MG; C- teliosporos de P. tuberculatum, São Miguel do Anta, MG; D- folhas de Lantana camara; E- eciosporos de Aecidium lantanae, Frade, RJ; F-
eciosporos de A. lantanae, Bacaxá, RJ; G- eciosporos de A.
lantanae, São Vicente de Paula, RJ.
3.7. Estudos citológicos
Além da germinação dos esporos ter sido baixa, durante o processo de coloração, grande parte do material obtido foi perdido, devido à série de lavagens requeridas pelo processo. Não foi possível observar basidiosporos isolados, porém observaram-se metabasídias de teliosporos germinados. As metabasídias observadas continham zero, dois ou até 10 pequenos núcleos. O tamanho e a forma das basídias também foram bastante variáveis (Figura 4).
M A A B B C C D D E E F F G G 4.072 3.054 2.036 1.636 1.018 506,5 396
Figura 3- Amplificação da região ITS de diferentes espécies, utilizando-se o par de primers ITS1 e ITS4. M- Marcador Kb DNA, A- uredosporos de Prospodium tuberculatum, Frade, RJ; B- uredosporos de P.
tuberculatum, Viçosa, MG; C- uredosporos de P. tuberculatum, Alto
da Boa Vista, RJ (provavelmente contaminado com DNA da planta); D- teliosporos de P. tuberculatum, São Miguel do Anta, MG; E- folhas de Lantana camara; F- eciosporos de Aecidium lantanae, Frade, RJ; G- eciosporos de A. lantanae, Bacaxá, RJ; H- eciosporos de A. lantanae, São Vicente de Paula, RJ; I- eciosporos de A.
lantanae, México; J- teliosporos de Puccinia lantanae, Peru; K-
teliosporos de Puccinia psidii- jambolão, Viçosa, MG; L- teliosporos de P. psidii- eucalipto, Viçosa, MG.
Figura 4- Metabasídias de Prospodium tuberculatum (indicadas por seta). 3.054 2.036 1.636 1.018 506,5 396 M A B C D E F G H I J K L