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No protocolo 2, camundongos machos receberam, por v.o., veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80), EBH (500 mg/kg), as frações aquosa e hexânica bem como 6- metoxi-7-preniloxicumarina (250, 500 e 1.000 mg/kg) ou FAE (250, 500, 750 ou 1.000 mg/kg) isoladas de P. sabulosa e, 1 h após, foram submetidos ao teste da hipnose induzida por éter etílico. Este teste foi utilizado com o intuito de biomonitorar o processo de purificação e isolamento do(s) constituinte(s) ativo(s) de P. sabulosa. Outros camundongos receberam o veículo (controle) ou DZP (0,75 mg/kg ou 1 mg/kg; i.p.; controle positivo).
Esquema 2 - Resumo do protocolo experimental 2
No protocolo 3, camundongos machos foram tratados, por v.o., com o veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE de P. sabulosa (250, 500 e 1.000 mg/kg) e, 1 h após, foram submetidos aos seguintes testes farmacológicos: LCE, hipnose induzida por pentobarbital sódico, convulsões induzidas por PTZ ou temperatura retal. O veículo foi utilizado como controle e DZP (0,75 - 2,5 mg/kg; i.p.) como controle positivo.
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Esquema 3 - Resumo do protocolo experimental 3
No protocolo 4, camundongos machos receberam, por via intracerebroventricular (i.c.v.), o veículo (PBS a 0,8 % de DMSO) ou DST (1), (2) e (3) ou STY (4), (5) e (7), nas doses de 0,3 fmol a 25 pmol, em um volume constante de 2 μL, e, 5 min após a recuperação postural, foram submetidos ao teste do LCE. O composto estiril-2-pirona (6) não foi testado uma vez que o rendimento durante o procedimento de extração química foi extremamente baixo, resultando em quantidade insuficiente para a realização dos testes farmacológicos.
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No protocolo 5, camundongos machos receberam salina ou flumazenil (FMZ, 1 - 10 mg/kg) i.p., e, 15 min após, foram tratados por via i.c.v. com veículo ou DST (1) ou (3), STY (4) ou (7) (40 fmol - 25 pmol). Cinco min após as injeções centrais, os camundongos foram avaliados no LCE.
Esquema 5 - Resumo do protocolo experimental 5
No protocolo 6, ratos machos foram divididos em 6 grupos de 6 animais cada. Nos três primeiros grupos, os ratos receberam uma injeção por via subcutânea (s.c.) de salina seguido da administração por v.o. de veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) (grupo 1), FAE de P. sabulosa (750 mg/kg) (grupo 2) ou DZP (5 mg/kg) (grupo 3) e, 1 h após, receberam uma injeção de PTZ (80 mg/kg; i.p.), sendo em seguida os registros do EEG analisados. Os demais grupos receberam FMZ (5 mg/kg) s.c. seguido da administração por v.o. de veículo (grupo 4), FAE (750 mg/kg) (grupo 5) ou DZP (5 mg/kg) (grupo 6) e, 40 min após, cada grupo recebeu uma dose suplementar de FMZ (5 mg/kg; s.c.). Vinte minutos após a última injeção de FMZ, as convulsões foram induzidas com PTZ e os registros do EEG foram analisados.
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Esquema 6 - Resumo do protocolo experimental 6
No protocolo 7, camundongos machos foram tratados, por v.o., com o veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE de P. sabulosa (250, 500 e 1.000 mg/kg) e, 1 h após, foram submetidos às convulsões induzidas por eletrochoque transcorneal máximo (ECM). Outros grupos experimentais receberam por via i.p., salina ou DZP (1, 5, 7,5 ou 10 mg/kg), fenitoína (7,5, 15 ou 30 mg/kg), fenobarbital (10, 15, 20 ou 30 mg/kg), carbamazepina (5, 10, 20 ou 30 mg/kg) ou ácido valpróico (100, 200 ou 300 mg/kg). Trinta minutos após salina ou DZP e 1 h após fenobarbital, carbamazepina, ácido valpróico ou fenitoína, os animais foram submetidos às convulsões por ECM.
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No protocolo 8, camundongos de ambos os sexos foram tratados oralmente com veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (250, 500 ou 1.000 mg/kg), por 30 dias consecutivos e, 1 h após o último tratamento, foram submetidos ao modelo do LCE.
Esquema 8 - Resumo do protocolo experimental 8
No protocolo 9 (toxicidade aguda), camundongos machos receberam por via i.p. veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (250 - 2.500 mg/kg), enquanto que outros animais receberam por v.o. veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (250 - 5.000 mg/kg), sendo em seguida avaliados no teste de screening Hipocrático. Outros grupos experimentais receberam veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (250 - 2.000 mg/kg) por v.o. e, 1 h após, foram submetidos aos testes do campo aberto ou rota-rod. Para o cálculo da DL50 oral, camundongos machos e fêmeas receberam veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (1.000 - 5.000 mg/kg; v.o.), e foram observados durante 15 dias consecutivos (sempre no mesmo horário) para identificação de
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Esquema 9 - Resumo do protocolo experimental 9
No estudo de toxicidade sub-crônica (Protocolo 10), camundongos de ambos os sexos receberam oralmente veículo (solução aquosa a 10 % de Tween-80) ou FAE (250, 500 e 1.000 mg/kg) por 32 dias consecutivos, sendo que no 30° dia os animais foram avaliados no LCE. A observação de possíveis sinais de toxicidade e a mensuração do peso corporal foi realizada diariamente (sempre no mesmo horário). No 32° dia, os animais foram sacrificados por anestesia profunda para a realização dos ensaios bioquímicos e hematológicos. Os animais utilizados neste protocolo são os mesmos que passaram pelo protocolo 8.
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3.5. Equipamentos e testes farmacológicos 3.5.1. Testes comportamentais
3.5.1.1. Labirinto em cruz elevado (Elevated plus-maze)
O labirinto em cruz elevado (LCE) é um teste de ansiedade animal desenvolvido por Handley e Mithany (1984) e surgiu a partir da adaptação do labirinto em Y criado por Montgomery, em 1955. Este teste foi validado inicialmente para ratos por Pellow et al. (1985) e, posteriormente, para camundongos por Lister (1987).
O LCE consiste de dois braços abertos (30 x 5 x 25 cm) e dois fechados (30 x 5 x 25 cm), opostos em forma de cruz grega e elevados a 45 cm do nível do chão. Os braços abertos e fechados estão conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). Os braços abertos são circundados por barras laterais de 0,25 cm de altura para evitar a queda dos animais. A plataforma e as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico transparente e o chão em acrílico preto. O teste foi realizado em uma sala com luz vermelha de forma que a intensidade de luminosidade no assoalho do equipamento foi de 3 lux.
Após os diferentes tratamentos, os animais foram colocados individualmente na plataforma central com a cabeça voltada para um dos braços fechados e o seu comportamento foi avaliado durante 5 min (Pellow et al., 1985). As medidas comportamentais registradas neste equipamento foram: tempo de permanência e número de entradas nos braços abertos e fechados (considerou-se a entrada em um dos braços quando a maior parte do corpo do animal estava dentro do respectivo braço), medidas etológicas de avaliação de risco tais como imersões de cabeça desprotegidas (unprotected head-dipping), estiramentos corporais protegidos (protected stretch-attend postures), exploração da região distal dos braços abertos (open-arms end activity) e comportamento de levantar (rearing).
O LCE é um dos testes etologicamente fundamentados, baseando-se nas respostas inatas de medo/ansiedade de diferentes espécies animais diante de situações naturalmente aversivas, enfatizando padrões relativamente estáveis de comportamento que são herdados para garantir a reprodução e a sobrevivência de cada espécie. Os comportamentos etológicos são definidos como movimentos ou posturas que sinalizam, para outros animais da mesma espécie ou de outras espécies, disposições comportamentais de agressão, de submissão, de afiliação e sexuais. Os parâmetros etológicos têm grande utilidade no estudo de drogas ansiolíticas/ansiogências e foram utilizados neste trabalho, associados aos
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parâmetros clássicos (espaço-temporais), para aumentar a sensibilidade do método, como proposto por Rodgers e Cole (1994).
Para a análise estatística dos dados e confecção dos gráficos, a porcentagem de entradas nos braços abertos foi calculada dividindo-se a freqüência de entradas nos braços abertos pela freqüência total de entradas, e esse índice multiplicado por 100. De maneira semelhante foi calculada a porcentagem do tempo em que os animais permanecerem nos braços abertos em relação ao somatório do tempo de permanência nos braços abertos e fechados, sendo o quociente obtido multiplicado por 100. Para os demais parâmetros observados, fez-se a soma simples das freqüências obtidas.
Figura 9 - Labirinto em cruz elevado. Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.2. Sono induzido por pentobarbital sódico
Grupos de camundongos receberam os pré-tratamentos por via oral (veículo, EBH ou FAE de P. sabulosa) 1 h antes da administração de pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.). A latência (s) para (tempo de indução do “sono”) e a duração (min) da perda do reflexo de endireitamento dos animais, após a injeção do barbitúrico, foi registrada com um cutoff de 3 h ou 10 h, para avaliar os efeitos do EBH ou FAE, respectivamente (Carlini et al., 1986). O DZP 0,75 ou 1 mg/kg (i.p.) foi utilizada como droga hipno-sedativa padrão.
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Figura 10 - Sono induzido por
pentobarbital sódico. Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.3. Sono induzido por éter etílico (sono etéreo)
A predição do sono etéreo segue, em linhas gerais, os mesmos princípios do sono barbitúrico, porém o agente indutor obviamente difere, neste caso é o éter etílico. Camundongos pré-tratados por via oral com o veículo, 6-metoxi-7-preniloxicumarina ou frações aquosa, hexânica ou acetato de etila de P. sabulosa foram colocados em uma câmara saturada (30 cm X 20 cm de diâmetro), de vidro transparente hermeticamente fechada. A saturação deu-se através do umedecimento de uma bola de algodão de tamanho padrão (6 g) com 5 ml de éter etílico colocado em uma plataforma localizada à 20 cm de altura em relação à superfície da câmara, 5 min antes da realização dos testes farmacológicos (Vieira, 2001; Duarte et al., 2007). Transcorrido o tempo para saturação da câmara, os animais foram introduzidos individualmente na mesma, registrando-se a latência para e a duração da perda do reflexo de endireitamento. Uma vez perdido o reflexo, esperou-se mais 1 min para a retirada de cada animal da câmara de saturação, e em seguida colocando-os em decúbito dorsal para registro da duração da hipnose, cujo término foi caracterizado pela recuperação da postura normal (Vieira, 2001; Duarte et al., 2007). DZP 0,75 ou 1 mg/kg (i.p.) foi utilizada como droga hipno-sedativa padrão.
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Figura 11 - Sono induzido por éter etílico (sono etéreo). Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.4. Convulsões induzidas quimicamente por pentilenotetrazol
Camundongos foram injetados com pentilenotetrazol (PTZ, 80 mg/kg, i.p.), e colocados em gaiolas de plástico para as observações. O tempo para manifestação da primeira convulsão (latência), assim como a duração, a incidência e a severidade das convulsões foram observadas e registradas até 30 min após a injeção de PTZ. A severidade das convulsões foi avaliada pela escala de reatividade convulsiva proposta por Czuczwar e Frey (1986): (0) = nenhum comportamento convulsivo, (1) abalos mioclônicos (myoclonic jerks), (2) crises clônicas sem perda do reflexo de endireitamento, (3) crises clônicas com perda do reflexo postural, (4) extensão tônica das patas posteriores e (5) extensão tônica com morte. O índice de severidade foi obtido pelo somatório total dos graus obtidos pela escala de reatividade.
Em ratos, após o registro basal do EEG por 20 min, os animais receberam PTZ (80 mg/kg, i.p.) e as convulsões foram observadas. A latência para e a duração do primeiro espasmo mioclônico/clônico ou latência para e a duração da primeira convulsão clônica generalizada, bem como a severidade e a letalidade, foram registrados. Seiscentos segundos foi o tempo máximo (cutoff) utilizado no cálculo dos parâmetros de latência e duração. A severidade foi registrada durante 1 h utilizando a escala de reatividade convulsiva de Racine modificada (1972): estágio 0: nenhuma alteração comportamental, estágio 1: contração das orelhas e face, estágio 2: espasmos mioclônicos isolados, estágio 3: clonias das patas anteriores, pescoço e/ou cabeça, estágio 4: clonias das patas anteriores, pescoço e/ou cabeça com comportamento de levantar (rearing) e queda, estágio 5: convulsão clônica generalizada (sem a extensão tônica das patas posteriores) iniciando
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com running seguido da perda do reflexo de endireitamento. O índice de severidade foi considerado o maior escore convulsivo alcançado por cada animal.
Figura 12 - Convulsões induzidas por pentilenotetrazol.
Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.5. Convulsões induzidas por eletrochoque transcorneal máximo
Após os tratamentos com as diversas preparações, os camundongos foram submetidos ao eletrochoque transcorneal máximo (ECM) utilizando corrente alternada produzida por um gerador de choque (PLAT-2) e liberada a partir de dois eletrodos de aço inoxidável. O estímulo supra-limiar do ECM foi ajustado com pulsos retangulares de 50 mA de intensidade liberados a 60 Hz com duração de 200 ms. Este estímulo resulta em convulsão tônico-clônica em 100 % dos animais testados em nossas condições de laboratório. O tempo total da extensão tônica das patas posteriores (em s) e a porcentagem dos animais que apresentaram a extensão tônica foram registrados (Swinyard et al., 1952).
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Figura 13 - Convulsões induzidas por eletrochoque transcorneal máximo.
Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.6. Campo-aberto (Open-field)
O campo-aberto (30 X 30 X 15 cm) foi confeccionado em acrílico (paredes transparentes e chão preto) e dividido em 9 quadrantes de 10 x 10 cm. A atividade exploratória dos animais teve como parâmetro a movimentação espontânea dos animais, aferida a partir da contagem do número de cruzamentos transpassados com as quatro patas e o número de comportamentos de levantar (rearing), registrados durante um período de 5 min, após os tratamentos. Esse teste permite uma avaliação da atividade estimulante ou depressora de um dado composto (Siegel, 1946; Archer, 1973).
Figura 14 - Campo aberto (Open-field). Fonte: Foto do
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3.5.1.7. Rota-rod
O aparelho constitui-se de uma barra horizontal de 2,5 cm de diâmetro subdividida em seis compartimentos, colocada a 25 cm de altura e girando a 12 r.p.m. Camundongos pré-selecionados (animais que permaneceram por pelo menos 1 min sobre a barra giratória do rota-rod em uma sessão de 2 min, 24 h antes do teste), foram colocados sobre a barra giratória 1 h após os tratamentos. O tempo total de permanência na barra giratória (em s) e o número de quedas durante a sessão foram registrados. Este teste permite avaliar se os tratamentos promovem incoordenação motora nos animais, por sedação e/ou relaxamento muscular (Duham e Myia, 1957).
Figura 15 - Rota-rod. Fonte: Foto do pesquisador.
3.5.1.8. Temperatura retal
A temperatura retal dos camundongos foi medida pela inserção de um termistor probe dentro do reto de cada animal. A leitura do registro da temperatura foi realizada por meio de um termômetro digital (Dixtal®). A sonda térmica foi colocada com vaselina e inserida 2 cm dentro do reto até a estabilização da temperatura (aproximadamente 20 s). A temperatura retal foi mensurada duas vezes, antes (T1) e 1 h após os diferentes tratamentos
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(T2). A variação da temperatura (∆T) foi estimada como ∆T=T2-T1, para cada animal (Carlini et al., 1986).
Figura 16 - Temperatura retal. Fonte: Foto do
pesquisador.
3.5.1.9. Cirurgias estereotáxicas para o implante dos eletrodos bipolares
Os procedimentos estereotáxicos para a implantação dos eletrodos bipolares foram realizados sob anestesia geral. A anestesia foi realizada com quetamina (100 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) (i.p.). Após a perda do reflexo álgico (“pedal withdrawal reflex”), verificada pela compressão da pata do animal (Cassella et al., 1997), procedeu-se à tricotomia a fim de expor a pele que recobre o crânio. Os ratos foram imobilizados individualmente no aparelho estereotáxico (Stoelting, mod. 300, USA), sendo fixados por duas barras auriculares colocadas nos meatos auditivos e uma presilha nasal fixada nos incisivos e no osso nasal. Em seguida, injetou-se lidocaína (com 2 % de vasoconstrictor) na face rostral da cabeça, por via subcutânea, para anestesia local e redução do extravasamento sangüíneo no momento da incisão. Realizou-se a raspagem do periósteo, expondo-se bem a superfície óssea e limpou-se a calota craniana com algodão embebido em água oxigenada, a fim de se visualizarem nitidamente as suturas cranianas, que foram utilizadas como referências na cirurgia estereotáxica. O crânio foi posicionado no aparelho estereotáxico de forma que o bregma e o lambda ficassem num mesmo plano horizontal. A calota craniana foi perfurada com uma broca odontológica para a fixação dos eletrodos profundos. Os eletrodos profundos eram bipolares e constituídos por dois filamentos de
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em toda a sua extensão, exceto nas extremidades. Para a avaliação do registro eletroencefalográfico profundo, cada eletrodo bipolar foi colocado na região CA3 esquerda do hipocampo. O registro do EEG superficial (cortical) foi realizado através do implante de um parafuso de aço inoxidável (1 mm de diâmetro) posicionado na região A3 direita, colocado de forma que sua extremidade apenas tocasse a superfície do córtex. A região CA3 hipocampal foi identificada pela sua coordenada antero-posterior (AP = - 3,3 mm), medial-lateral (ML = + 2,5 mm) e dorso-ventral (DV = - 3,8 mm), enquanto que a região A3 cortical pela coordenada antero-posterior (AP = - 1,5 mm) e medial-lateral (ML = - 3,0 mm), ambas determinadas segundo o Atlas Estereotáxico de Paxinos & Watson (1986). Um parafuso adicional foi implantado no seio frontal e serviu como eletrodo de referência (indiferente). Tanto o eletrodo bipolar quanto o eletrodo cortical foram conectados a um micro-conector de saída e, em seguida, a área aberta foi preenchida com acrílico auto- polimerizável (JET Artigos Odontológicos Clássico Ltda., São Paulo, Brasil), que se solidifica rapidamente, formando uma proteção aos eletrodos e mantendo-os fixos. A seguir, a pele rebatida foi suturada na região anterior e posterior de forma que o soquete (conjunto de eletrodos mais micro-conector) ficasse exposto.
Figura 17 - Cirurgia estereotáxica para o implante dos eletrodos
bipolares. Fonte: Foto do pesquisador.
Após o término das cirurgias, cada animal foi aquecido embaixo de uma lâmpada de 40 W, a fim de amenizar a hipotermia induzida pela anestesia geral e, depois da recuperação total, foram reconduzidos aos pares às suas caixas recebendo água e ração à
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vontade, por 5 dias antes do teste experimental. Neste período de recuperação os animais foram manipulados somente durante a troca de maravalha das caixas.
3.5.1.10. Registros de eletroencefalograma (EEG)
O eletroencefalograma (EEG) foi obtido através de um sistema digital poligráfico (BIOPAC System, MP-100/WSW, Inc) no período das 13 às 17 h. No dia dos registros do EEG (5 dias após a estereotaxia), cada animal foi colocado individualmente em uma caixa de vidro (0,3 x 0,5 x 0,4 m) contendo serragem no chão, e esta caixa inserida dentro da gaiola de Faraday (1,0 x 0,6 x 0,7 m). O micro-conector do animal foi acoplado a um cabo elétrico de aquisição que transmitia os sinais de atividade elétrica cerebral para o sistema de amplificação e polígrafo. Os sinais elétricos foram amplificados 20.000 vezes, filtrados em 0.5-30 Hz, em uma taxa amostral de 256 Hz e registrados através do software ACQ- Knowledge versão 3.2. Após um período de habituação de 30 min, fez-se um registro eletrográfico basal de 20 min seguido pelos tratamentos. Durante os tratamentos (ver item 3.4), o EEG foi registrado continuamente por 1 h. Subseqüentemente, as convulsões foram induzidas pela injeção intraperitoneal de PTZ (80 mg/kg) e o EEG foi registrado com um cutoff de 1 h. O comportamento de cada animal foi observado, concomitantemente ao registro eletroencefalográfico, através de uma webcam localizada dentro da gaiola de Faraday e gravado em um computador. A análise do EEG foi realizada pela inspeção visual direta, buscando-se detectar achados eletrográficos característicos de atividade epileptiforme.
3.5.2. Ensaios bioquímicos
Os ensaios de ligação foram utilizados para avaliar a possível interação dos compostos isolados de P. sabulosa com o sítio de ligação BDZ do complexo receptor GABAA, em membranas sinaptossomais de córtex cerebral de ratas. Os compostos estudados foram: 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxidihidroestiril)-2-pirona (1) [dihidroestiril-2-pirona (1)], 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-14-metoxi-dihidroestiril)-2- pirona (2) [dihidroestiril-2-pirona (2)], 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-10,14- dimetoxidihidroestiril)-2-pirona (3) [dihidroestiril-2-pirona (3)], 4-metoxi-6-(11,12- metilenodioxiestiril)-2-pirona (4) [estiril-2-pirona (4)], 4-metoxi-6-(11,12-metilenodioxi-
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14-metoxiestiril)-2-pirona (5) [estiril-2-pirona (5)] e 4-metoxi-6-(11,12-dimetoxiestiril)-2- pirona (7) [estiril-2-pirona (7)]. Os nomes dos compostos foram abreviados da seguinte forma: DST (1), (2) e (3) ou STY (4), (5) ou (7), respectivamente.
3.5.2.1. Ensaios de ligação (binding do [3H]-flunitrazepam)
3.5.2.1.1. Animais e preparação das membranas sinaptossomais
Os animais foram sacrificados com guilhotina e os cérebros foram rapidamente removidos e os córtices dissecados sobre gelo e congelados a -20 °C. Posteriormente, os córtices foram homogeneizados em 10 volumes de uma solução de sacarose 0,32 M, seguido de centrifugação a 900 g durante 10 min. O sobrenadante foi centrifugado a 100.000 g durante 30 min. O pellet foi lavado duas vezes com 30 volumes de tampão Tris- HCl 25 mM pH 7,4. Em seguida foi realizada uma nova centrifugação por 30 min a 100.000 g para recuperar o pellet de cada lavado. A ressuspensão final foi realizada com o mesmo tampão do lavado de tal forma que a concentração de proteínas, medida pela técnica de Bradford, foi de 2-4 mg/ml. As membranas sinaptossomais assim obtidas foram conservadas a -20 °C até o momento de uso nos ensaios de ligação.