Resumo dos achados

4.5.1 L-selectina

Nossos achados de expressão gênica mostraram maior expressão de SELL em tumores malignos da tireoide (p=0,0027) e evidenciaram que a L-selectina pode diferenciar padrão folicular (p=0,0057). A expressão gênica de SELL foi menor em tumores que apresentavam locais com células de Hürthle quando comparado a tumores que não possuíam esses locais (p<0,0001). Em relação a expressão proteica, tanto nuclear quanto citoplasmática, esta mostrou ser mais fraca em tumores malignos (p<0,0001 e p=0,0001, respectivamente) e ambas também diferenciaram padrão folicular (p=0,0002 e p=0,0005, respectivamente). Além disso, a expressão citoplasmática de L-selectina mostrou-se mais intensa em casos que apresentavam metástase linfonodal ao diagnóstico (p=0,0417) do que aqueles que não apresentaram essa característica.

4.5.2 PNAD

A expressão apical de PNAd não foi diferente entre tumores malignos e benignos da tireoide (p=0,0563) e também não distinguiu os tipos histológicos avaliados (p=0,0738), entretanto, 81,4% dos casos que possuíam metástase linfonodal ao diagnóstico foram positivos para expressão apical de PNAd ao passo que 37,5% dos casos que não possuíam essa característica foram negativos (p=0,0291). Considerando a proporção de expressão apical de PNAD, os tumores malignos apresentaram majoritariamente expressão difusa (p=0,0114) e observamos também um crescente aumento de proporção difusa conforme o

tecido tireoidiano sofria desdiferenciação celular (p=0,0116). Contudo, cerca de 46% dos casos que possuíam invasão tiveram proporção focal e cerca de 42% dos casos que não possuíam essa característica foram negativo, além disso, cerca de 36% dos casos que não possuíam metástase a distância tiveram proporção difusa e apenas 02 casos que possuíam essa característica tiveram esse padrão de proporção (p=0,0454).

Em relação a expressão citoplasmática de PNAd, cerca de 51% dos tumores malignos foram positivos enquanto que apenas cerca de 7% dos benignos apresentaram positividade citoplasmática para PNAd (p<0,0001), além disso, a expressão citoplasmática mostrou-se diferente entre os tipos histológicos avaliados (p<0,0001), mas não correlacionou-se com nenhuma das demais características avaliadas.

4.5.3 ICAM-1

A expressão gênica de ICAM1 foi maior em tumores malignos da tireoide (p=0,0001) e mostrou-se capaz de diferenciar tipos histológicos e tumores de padrão folicular (p=0,0114), além disso, sua expressão foi menor em tumores que apresentavam locais com células de Hürthle (p<0,0001) e foi maior em tumores que possuíam infiltrado linfocitário (p=0,0064).

Avaliando a expressão proteica apical de ICAM-1 observamos que 24,3% dos tumores malignos apresentaram intensidade moderada enquanto apenas 6,0% dos benignos tiveram esse padrão de intensidade (p=0,0014). A expressão de ICAM-1 correlacionou-se com menor idade ao diagnóstico (p=0,0312) e com menor tamanho de tumor (p=0,0151).

4.5.4 LFA-1

A expressão gênica de ITGAL não foi diferente entre tumores malignos e nódulos benignos da tireoide, porém, esse gene mostrou-se mais expresso em casos que apresentavam infiltrado linfocitário (p=0,0244) e correlacionou-se com ausência de invasão linfovascular (p=0,0427), ausência de extensão extratireoidiana (p=0,0111) e ausência de capsula (p=0,0408). A expressão gênica de ITGAL também foi maior em casos que apresentavam metástase distante ao diagnóstico (p=0,0217).

Já em relação a expressão proteica de LFA-1, observamos maior negatividade em tumores malignos (p=0,0168) além de uma crescente negatividade conforme o tecido tireoidiano sob desdiferenciação (p=0,0489). A expressão moderada de LFA-1 correlacionou-se com maior idade ao diagnóstico (p=0,0376).

5. Discussão

A associação entre inflamação crônica e CT já é bem descrita na literatura (99). Várias células e mediadores do sistema imunológico já foram estudados em CT e associados com progressão e prognóstico tumoral, tendo nosso grupo se dedicado intensamente à compreensão e à aplicação clínica de tais fatores (3, 18-20, 25, 26, 100- 105). Um dos fatores que possuem papel central na progressão do tumor é o microambiente tumoral, pois pode suprimir a malignidade ou induzir a progressão tumoral, dependendo da ação de fatores patogênicos presentes neste microambiente tumoral (106, 107). Esse microambiente é composto por fibroblastos, células sanguíneas, vasos sanguíneos e linfáticos, componentes da matriz extracelular e células do sistema imune.

As moléculas de adesão celular desempenham papel importante em diversos mecanismos distintos do nosso organismo. O principal deles é a migração de leucócitos para sítios de inflamação porém, essas moléculas também possuem papel importante estimulando sinais intracitoplasmáticos que regulam a diferenciação, sobrevivência e proliferação celular (108).

Essas moléculas vem sendo estudadas em diversos tipos de câncer como mama, colorretal, próstata, tireoide, entre outros. O valor prognóstico e o significado clínico da expressão das moléculas de adesão celular também vem sendo estudados (109). Devido a suas múltiplas interações em diversas vias de sinalização, as moléculas de adesão celular correlacionam-se, em alguns tipos tumorais, com bom prognóstico e indicam papel supressor tumoral, ao passo que para outros tipos de neoplasias, sua expressão é

correlacionada com pior prognóstico e características de agressividade (32, 37, 42-46, 61- 65, 69, 70, 79, 80, 83, 110-116).

5.1 L-selectina

A L-selectina é uma molécula que atua principalmente na fase de captura e rolamento das células que estão em processo migratório, sejam células leucocitárias (30, 31, 37, 41) ou metastáticas (45, 47). Sua expressão vem sendo estudada em diversos tipos de câncer como: ovário (110), bexiga (42) e tireoide (43, 46, 49) e normalmente está relacionada a agressividade tumoral.

Um estudo importante (46) para a concepção da ideia de relação entre desdiferenciação celular, autoimunidade e inflamação em câncer de tireoide avaliou a expressão de L-selectina em 15 CPT, 04 tecidos tireoidianos normais (contralaterais) e 06 TH e encontraram maior expressão de L-selectina em CPT quando comparado a tecido normal (p=0,0040). De fato, em nosso estudo observamos maior expressão gênica de SELL em tumores malignos quando comparado a nódulos benignos da tireoide (p=0,0027).

Observamos também que a expressão gênica de SELL foi capaz de diferenciar o padrão folicular, uma vez que mostrou-se diferente nas comparações entre os tipos histológico (p=0,0057) principalmente quando comparado de forma individual AF com CPT (p=0,0018) e AF com CFT (p=0,0078), mas não quando AF com bócio (p=0,1058). Essa diferença entre as medianas de expressão muito provavelmente ocorre devido à baixa expressão gênica de SELL em AF. Além disso, também observamos que ocorre

diminuição de expressão gênica de SELL quando há presença de locais com células de Hürthle no tumor, de forma curiosa, a casuística de AF, quase em sua totalidade, possui locais com células de Hürthle. A presença dessas células em tumores tireoidianos ainda não está clara e acredita-se que estejam relacionadas a agressividade tumoral; além disso, sabe-se que esse fenótipo celular é ocasionado principalmente por mutações no DNA mitocondrial porém, esse mecanismo ainda não está claro (117), bem como ainda não há correlação entre a presença de locais com células de Hürthle e expressão de moléculas de adesão celular.

Também já se demonstrou maior expressão de SELL em CPT com infiltrado linfocitário (46). Nossos achados sugerem uma tendência de maior expressão em tumores com infiltrado linfocitário (1,40±2,16 UA) quando comparado a tumores que não apresentavam essa característica (0,88±1,44 UA) porém, essa diferença não foi estatisticamente significante (p=0,1883), assim como também não encontramos relação entre a expressão gênica de SELL e características de agressividade, muito semelhante a literatura (46).

Estudos em câncer de bexiga avaliaram a expressão proteica de L-selectina em tumores com diferentes níveis de agressividade e observaram expressão nuclear de L- selectina apenas em tumores menos invasivos (42). Nós também observamos expressão nuclear mais intensa em nódulos benignos da tireoide que, de fato, não possuem potencial invasivo ou metastático. Por outro lado, observamos uma expressão decrescente de L- selectina nuclear em relação aos tipos histológicos, sugerindo assim, que essa molécula diminua sua expressão proteica nuclear conforme as células neoplásicas vão se desdiferenciando. O mesmo foi observado em relação a expressão citoplasmática de L- selectina.

Porém, diferente de nossos achados, Kobawala et al. (43) encontraram maior expressão proteica de L-selectina em CPT quando comparado a nódulos benignos. Kobawala et al. (43) estudaram a expressão de L-selectina membranar, diferente de nossos métodos, que avaliaram expressão de L-selectina nuclear ou citoplasmática. De fato, acreditamos que a expressão membranar de L-selectina deva ser maior em tumores malignos da tireoide, uma vez que estes podem utilizá-la para o processo de metastatização e talvez seja este o mesmo motivo do nosso achado de expressão nuclear e citoplasmática de L-selectina terem sido encontrados menos frequentes em tumores malignos, uma vez que, após sua ativação, a L-selectina é clivada liberando sua porção extracelular em sua forma solúvel (37, 42), o que poderia ocasionar remanejamento da porção intracelular para ser reaproveitada. Nossa hipótese está esquematizada na Figura 49.

Figura 49: Esquema de hipótese para aumento de expressão gênica e diminuição de expressão proteica de L-selectina. Adaptado (41).

Assim, a ativação dessa molécula em tumores malignos seria maior, contribuindo para seu potencial metastático. De fato, a literatura vem reportando maior concentração sérica de L-selectina em diversos tipos de tumores malignos (44, 85, 110, 118). Acreditamos que o aumento de L-selectina solúvel e o possível remanejamento da porção citoplasmática, talvez, sirvam de estímulo para o aumento dos níveis de mRNA, explicando assim o porquê observamos maior expressão gênica em tumores malignos ao passo que a expressão proteica tanto nuclear quando citoplasmática foi menor e menos intensa. Porém, não podemos nos esquecer que a L-selectina é uma molécula que atua em um processo que envolve um emaranhado de outras moléculas, citocinas, quimiocinas, fatores de transcrição, vias de sinalização e demais componentes que atuam de forma sistêmica e integrada, sendo assim, talvez sua expressão possa estar sendo modulada por outros fatores que ainda não foram descritos por ter essa função.

Observamos também maior expressão citoplasmática de L-selectina em tumores que possuíam metástase linfonodal ao diagnóstico. Nestes, a expressão de L-selectina foi predominantemente moderada a forte. Estudos em câncer de bexiga encontraram os mesmos achados (42). O que corrobora, de fato, com a função da L-selectina em tumores metastáticos, sendo utilizada, assim, como uma possível molécula chave na adesão de células neoplásicas para migração a outros sítios (47, 48).

5.2 PNAd

A PNAd é um conjunto de sialomucinas sulfatadas que são consideradas um marcador específico de vênulas endoteliais altas (31, 33, 119). São ligantes de L-selectina e ativam epítopos dessa molécula promovendo uma ligação de alta afinidade (33, 35, 119- 121). Inicialmente, acreditava-se que sua expressão era restrita as HEVs, porém, há relatos de sua expressão em células endoteliais de pele normais e neoplásicas desde a década de 1990 (120), sua expressão também já foi reportada em células de ovário (122) e no tecido endotelial em estados inflamatórios e autoimunes como no caso de diabetes tipo I (121).

Nós observamos sua expressão em células neoplásicas tireoidianas (malignas e benignas), tanto na forma apical quando na forma citoplasmática. De fato, a literatura reporta a expressão de PNAd em células endoteliais de HEVs na forma apical e basolateral, além disso, esse padrão distinto de expressão se dá de acordo com a enzima responsável pela sulfatação da molécula (33). Quando expresso de forma apical em HEVs, a PNAd é capaz de cooperar com quimiocinas para selecionar linfócitos, com L- selectina expressa em sua membrana que irão migrar da corrente sanguínea para os linfonodos (123, 124). Porém, em nossos achados, não observamos diferença de expressão de PNAd apical em tecidos de nódulos benignos e tumores malignos (p=0,0563) e nem correlação com a presença de infiltrado linfocitário, que seria, talvez, um comportamento lógico pensando na função e expressão dessa molécula em células de HEVs contudo, é importante ressaltar avaliamos a expressão de PNAd em células tireoidianas neoplásicas e suas funções e padrões de expressão nesse caso ainda não são esclarecidos pela literatura. Além disso, observamos predominância de positividade entre

os tecidos malignos que possuíam metástase linfonodal ao diagnóstico (p=0,0291) porém quando avaliamos as diferentes intensidades de expressão essa correlação não foi estatisticamente significativa.

Interessante que avaliando a proporção de expressão apical em difusa e focal, observamos predominância de expressão difusa em tumores malignos da tireoide (p=0,01114), bem como uma crescente proporção difusa, ao passo que o tecido tireoidiano sobre desdiferenciação (p=0,0116) o que sugere maior utilização dessa molécula em tecidos malignos, corroborando com a ideia de que seja utilizada em processos migratório de células tumorais (47).

Contudo, a maioria dos casos que possuíam invasão apresentaram proporção focal, ao passo que cerca de 42% dos casos que não possuíam invasão foram negativos para a expressão apical de PNAD e, além disso, cerca de 36% dos tumores malignos que não possuíam metástase a distância apresentaram proporção difusa enquanto apenas 02 casos que possuíam esse tipo de metástase tiveram padrão de proporção difusa. Esses dados sugerem um comportamento supressor de PNAD apical em células tumorais tireoidianas, talvez os processos biológicos que envolvem a proliferação de células tumorais desencadeiem a ativação de fatores de transcrição, vias de sinalização ou até mesmo a produção de moléculas que modulem a função de PNAd. Entretanto, avaliando a expressão citoplasmática de PNAD, observamos uma predominância de positividade em tumores malignos (52%) enquanto que apenas 7% dos benignos foram positivos (p<0,0001), sugerindo que, talvez a PNAd atue em outros processos celulares e não somente na migração propriamente dita.

Estudos demonstram que vasos que expressam PNAd são encontrados em tumores sólidos como mama, melanoma, pulmão e ovário. Estudos em câncer de mama,

carcinoma oral e melanoma sugerem que a presença de HEVs que expressam PNAd está associada com bom prognóstico (125-128), normalmente vascularização tumoral está relacionada a pior prognóstico, porém esse tipo específico de vaso vem sendo descrito com papel na manutenção da inflamação crônica pelo recrutamento em larga escala de leucócitos (35, 119, 121, 129, 130). De fato, quando pensamos na presença de HEVs próximo ao sítio tumoral, vemos o paradoxo, de um lado a possibilidade de fornecimento de nutrientes e funcionamento de rota metastática para essas células neoplásicas (47) e de outro o recrutamento de leucócitos para órgãos linfoides secundários e para o próprio tumor (121, 123, 124, 129, 130). Estudos do nosso grupo demonstram a importância da presença de infiltrado linfocitário em tumores tireoidianos e sua correlação com bom prognóstico para os pacientes (18, 101), portanto acredita-se que a presença desses vasos também esteja relacionada a melhor prognóstico. Entretanto, a expressão de PNAd em células neoplásicas e suas funções ainda não está clara.

5.3 ICAM-1

ICAM-1 é uma glicoproteína presente em baixos níveis na membrana celular de diversas células em nosso organismo, uma vez que está envolvida tanto nas respostas imunes inatas quanto nas adaptativas (131). Porém, essa molécula também participa de mecanismos de progressão e pode se relacionar com o prognóstico em alguns tipos de câncer (111, 112, 132). Sugere-se que a proteína ICAM-1 atue como facilitadora da disseminação de células cancerosas através do recrutamento de células inflamatórias que liberam fatores estimulantes da proliferação celular, angiogênese e invasão (40).

O aumento da expressão de ICAM-1 tem sido relacionado ao tecido malignos tireoidiano desde a década de 1990 (64, 114). Hayes e Seigel analisaram cerca de 300 amostras de tecidos normais, malignos e metastáticos de diversos tumores como câncer colorretal, de mama, pulmonar, pancreático e tireoidiano e encontraram superexpressão de ICAM-1 em tecidos malignos (63). Mais recentemente, Buitrago et al. estudaram a expressão gênica e proteica de ICAM-1 em tecidos de 74 pacientes com doenças tireoidianas, sendo 14 tumores benignos, 39 tumores malignos, 5 tireoidites de Hashimoto e 8 tecidos tireoidianos normais. Tumores malignos apresentam maior expressão de ICAM-1 quando comparados a tumores benignos, tireoidites e tecidos normais (62).

Nossos achados confirmam esses estudos, uma vez que a expressão gênica de ICAM1 foi maior em tumores malignos da tireoide (p=0,0001) e, de forma semelhante para expressão proteica, a maioria dos casos positivos com intensidade moderada também eram malignos (p=0,0014), corroborando a literatura (133, 134). Zhang et al. avaliaram a expressão de ICAM-1 por imunoistoquímica e por western blotting em 245 pacientes sendo 132 CPT, 10 CFT, 15 AF, 72 TH e 16 bócios. Encontraram 85,6% de positividade para ICAM-1 em CPT e 18,0% em TH (65). Entretanto, nós observamos que 52,5% (n=21) dos bócios, 51,2% (n=22) dos AF e 31,8% (n=7) dos CFT também foram positivos para ICAM-1. Ainda assim, acreditamos que a expressão de ICAM pode auxiliar no diagnóstico diferencial de nódulos de padrão folicular.

Buitrago et al. encontraram maior expressão da ICAM-1 em tumores com características de agressividade como a presença da mutação BRAF V600E, invasão extratireoidiana e metástase linfonodal (62). Sugeriu-se que a regulação da expressão de ICAM-1 em células tumorais tivesse papel importante nos processos metastáticos nos quais células tumorais invasivas simulariam o processo de adesão celular nos vasos sanguíneos, evitando o reconhecimento do sistema imunológico e atingindo sítios

distantes (111). Por outro lado, outros estudos sugerem que ICAM-1 está envolvida com a supressão tumoral interferindo na ativação da via PTEN/PI3K/AKT, mas esse mecanismo ainda não está claro (113). Também acredita-se que ICAM-1 possa atuar como uma molécula supressora tumoral, inibindo os macrófagos M2 (116) que possuem papel importante na regulação imunológica (135), remodelamento do tecido (136) e progressão tumoral (137). Sabe-se que a maioria dos macrófagos presentes no microambiente tumoral são macrófagos do tipo M2, que estão associados com angiogênese tumoral, metástase e pior prognóstico (116, 138, 139).

Nós observamos que a expressão gênica de ICAM1 foi maior em tumores que apresentavam infiltrado linfocitário (p=0,0064) enquanto a expressão proteica de ICAM- 1 correlacionou-se com menor tamanho de tumor (p=0,0151). Sabemos que a presença de infiltrado linfocitário pode estar relaciona a bom prognóstico (18), o que evidencia, talvez, um possível papel supressor ou contensor de crescimento de ICAM-1 nestes tumores tireoidianos, ao contrário do que sugere a literatura (62-65).

5.4 LFA-1

O principal ligante da ICAM-1, a LFA-1, possui expressão em membrana de leucócitos (76) porém também vem sendo descrita em diversos tipos de células tumorais (69, 77-79). Embora também tenha sido associada com progressão metastática em linfomas (140) e em câncer colorretal (141), esse mecanismo não está bem definido.

A LFA-1 é uma molécula que encontra-se inativa em sua forma basal; dessa forma, necessita de ativação para interagir com seus ligantes. O modelo de ativação de LFA-1 mais aceito consiste em admitir que essa molécula de adesão celular pode adotar

diferentes conformações e que isso afeta a sua afinidade com outras moléculas, ou seja, em sua forma basal sua estrutura conformacional possui baixa afinidade, porém para realizar sua interação com ICAM-1 essa moléculas necessita estar em sua conformação de alta afinidade (70). É conhecido também, que de mesmo modo que as demais integrinas, LFA-1 também é capaz de mediar sinais intracelulares modulando o crescimento, diferenciação e sobrevivência celular (142-145).

Nossos achados demonstram maior expressão gênica de ITGAL em casos que não apresentavam invasão linfovascular (p=0,0427) e nem extensão extratireoidiana (p=0,0111) e foi maior em casos que apresentavam infiltrado linfocitário (p=0,0244). Além disso, sua expressão proteica, quando em intensidade moderada a forte, correlacionou-se com maior idade ao diagnóstico (p=0,0376), sugerindo assim, que a LFA-1 pode possuir papel importante na supressão tumoral, o que vai de encontro ao que acreditamos para a molécula ICAM-1, seu principal ligante, nesses tumores tireoidianos. Sabemos que a estrutura conformacional de LFA-1 se altera para que ocorra a interação. De fato, estudos em adenocarcinoma colorretal (79) sugerem uma correlação negativa entre a expressão de LFA-1 e o processo metastático, sugerindo, assim, um possível papel supressor tumoral. Sua expressão também foi encontrada nos focos metastáticos linfonodais, o que é esperado, uma vez que a LFA-1 é uma molécula chave no processo migratório. Nós também encontramos mais expressão em casos que não possuíam invasão linfovascular ou extensão extratireoidiana e em casos que apresentavam metástase linfonodal. Dessa forma, mesmo que em determinadas situações, a LFA-1 contribue para o processo metastático, acredita-se que desempenhe, majoritariamente, um papel supressor tumoral.