RELACIONADOS A IMPORTANTES PROCESOS CELULARES
As listas dos genes up e down regulados com fold change ≥2.0 e ≤-2.0 foram submetidas ao STRING 10.5 para a construção de redes PPI. Após as construções, as redes foram de forma individual visualizadas e analizadas pelo Cytoscape 3.5.1 que é um software de reconhecimento de anotações funcionais de genes provenientes de diferentes bancos de dados. As diferenças dos valores dos transcritos presentes nas listas dos observados na interação pelo STRING pode ser devido a ferramenta utilizada não ter reconhecido o gene ou o próprio gene não ter função enzimática reconhecida.
A lista para os genes up regulados gerou no Cystoscape uma rede com 518 nós e 1.242 conectores (Figura 19A). A identificação das proteínas centrais deu-se pelo plugin Centiscape e CytoHubba que mostrou quais se comportaram como hubs, tendo importância na interação da rede por apresentarem número elevados de conexões. Para serem consideradas hubs o valor node degree teve como valor máximo igual a 41 e média igual a 5. O top 12 das proteínas consideradas hubs da lista dos genes up regulados estiveram ligados principalmente a regulação da transcrição (POLR2G, HIST1H2BD, HIST1H2BB); divisão celular (MAPK3, CDC23, PIK3C3); propriedades neuroprotetoras (ENO2) e reparo de DNA (POLA1). Cinco
proteínas com alto valor node degree apresentaram também alto valor de betwenness, sendo consideradas hub-gargalos, entre elas estão: MAPK3, PIK3C3, POLA1, UCKL1, TNF e POLR2G (Figura 19B e Tabela 4).
A clusterização dos genes, pela ferramenta MCODE, foi analisada quanto ao valor do seu score, sendo selecionadas as que apresentaram valor igual ou maior que 2.5. As subredes dos genes up regulados estiveram relacionados principalmente com o metabolismo normal dos monócitos (Figura 19C). Através do BiNGO foi possível observar os processos biológicos relacionados a regulação da transcrição, ao crescimento e divisão celular, transporte de proteína, reparo de DNA, elongação do RNA, resposta a estímulos de danos ao DNA, e a processos metabólicos em geral (Gráfico 1). No cluster 2, relacionado com a transcrição, esteve presente o gene que codifica para a proteína POLR2G com comportamento de hub-gargalo. Uma segunda análise desse cluster foi realizada com o objetivo de observar dentro dessa subrede as proteínas com alto valor node degree. Em destaque podemos observar as relacionadas ao complexo de iniciação da transcrição (TAF6L, TAF4B, TAF5) e as RNA polimerase (POLR2G, POLR3H, ELL2).
Figura 19: Análise da rede PPI pelo cytoscape da rede UP regulada. (A) Rede PPI mostrando 518 nós e 1242 conectores. Os reguladores transcricionais previstos pela ferramenta iRegulon para os genes up regulados foram ZNF143 e FLI1. Os principais reguladores estão destacados em nós amarelos e os genes regulados em verde. (B) Principais genes destacados pelo CytoHubba com os mais altos valores de node degree, sendo proteínas hubs, e abaixo os principais genes destacados pelo CytoHubba com alto valor de betwenness. (C) Sub-redes obtidas pelo MCODE com maior score (pontuação): O cluster 1 (score 6) mostra GO relacionada a processos baseados no microtúbulo, o cluster 2 (score 5.57) está associado à transcrição e o cluster 3 (score 5.18) está relacionado à organização de organelas. Os principais reguladores desses clusters são: KIF22, HNF1A, ZNF143, ELK1, ETS1, POU2F2, NFYA, NRF1, YY2 e H3S1.
Tabela 4: Os dez principais genes hubs da rede up regulada
Gene Betweenness Node Degree
MAPK3 5.275.609 41 POLR2G 15.739.374 29 UCKL1 2.174.875 27 POLA1 17.761.772 26 PIK3C3 22.520.463 23 CDC23 2.381.819 23 ENO2 1.288.208 23 HIST1H2BD 14.705.416 22 HIST1H2BB 8.465.010 20 GTF2B 8.465.010 20
Gráfico 1: Distribuição da Ontologia Gênica (OG) para processos biológicos da rede up regulada, com um valor p<0.05 sendo estatisticamente significativo após a análise com o plugin BiNGO do Cytoscape.
Para a lista dos genes down regulados formou-se uma rede com 1.253 nós e 10.184 conectores (Figura 20A). Através da centralidade, as proteínas que foram consideradas hubs tiveram valor degree entre 194 o máximo e 16 a média. Entre as doze proteínas com valores mais altos de node degree pôde-se observar genes relacionados à regulação da expressão gênica (POLR2F, POLR2B); reparo do DNA e respostas celulares ao dano ao DNA (RAD51); controle do ciclo celular, remodelação da cromatina e metilação (IMPDH2, PPP2CA, CDK1, EHMT2); processo metabólico acetil-CoA (ACACA); e resposta celular ao lipopolissacarídeo e EROs (SRC). Da lista destes 12 principais genes hubs, as proteínas com alto valor node degree e betweenness sendo consideradas hubs-gargalos, com importância no controle do fluxo de informações da rede, foram ACACA, SRC e RAD51 (Figura 20B
e Tabela 5). O gene APEX1 que codifca para APE1/Ref-1, uma importante enzima
com função no reparo de DNA e fator redox, apresentou valor node degree 40, ou seja acima da média, porém não apreceu entre os top 12.
A rede dos transcritos down regulados após o MCODE, para clusterização dos grupos de proteínas, mostrou categorias funcionais das subredes com score maior que 2.5 relacionadas principalmente ao controle do ciclo celular (Cluster 1 - score = 18.29); a expressão gênica (Cluster 2 - score = 17.98); e a processos metabólicos de ácidos nucleicos, incluindo resposta ao estresse e reparo de DNA (Cluster 3 - score = 16.96) (Figura 20C). Estes dados também foram observados através do BiNGO que mostrou subredes com categorias funcionais relacionadas ao reparo de DNA, replicação e resposta ao estresse; processo metabólico de RNA mensageiro; expressão gênica; e ciclo celular (Gráfico 2). A maioria dos genes que se comportam como hub estão presentes nos principais clusters que apresentaram processos biológicos relacionados a expressão gênica, processo metabólico de RNA, à regulação do ciclo celular, modificação de proteína pós-traducional, ao reparo e replicação do DNA, e resposta a estímulos causadores de estresse. Esses genes hub codificam para as proteínas CDK1, POLR2B, POLR2F, IMPDH2, PPP2CA e as hub-gargalos para CDK1, POLR2B, EHMT2, IMPDH2 e PPP2CA
Figura 20: Análise da rede PPI pelo cytoscape da rede DOWN regulada. (A) Rede PPI mostrando 1.253 nós e 10.184 conectores. Os reguladores transcricionais previstos pela ferramenta iRegulon para os genes down regulados foram GABPA e NRF1. Os principais reguladores estão destacados em nós amarelos e os genes regulados em vermelho. (B) Principais genes destacados pelo CytoHubba com os mais altos valores de node degree, sendo proteínas hubs, e abaixo os principais genes destacados pelo CytoHubba com alto valor de betwenness. (C) Sub-redes obtidas pelo MCODE com maior score (pontuação): O cluster 1 (score 18.29) mostra GO relacionado ao controle do ciclo celular, o cluster 2 (score 17.98) está associado à expressão gênica e o cluster 3 (score 16.96) está relacionado à processos metabólicos de ácidos nucleicos, que incluem resposta ao estresse e genes de reparo de DNA . Os principais reguladores desses clusters são: GABPA, ARNTL, E2F4, SIN3A, ELK1, YY2, E2F3, ETV8 e NRF1.
Tabela 5: Os dez principais genes hub da rede down regulada Gene Betweenness Node Degree
POTEE 2.923.457 194 CDK1 1.148.284 160 POLR2B 8.056.172 144 ACACA 15.167.523 143 SRC 1.555.082 131 EHMT2 8.016.873 116 POLR2F 4.130.504 116 IMPDH2 9.255.491 114 PPP2CA 7.241.356 113
Gráfico 2: Distribuição da Ontologia Gênica (OG) para rede down regulada, com um valor p<0.05 sendo estatisticamente significativo após a análise com o plugin BiNGO do Cytoscape.
5.7 O TRANSCRIPTOMA REVELA NOVOS REGULADORES TRANSCRICIONAIS