Retinitis pigmentosa protein 2 (RP2)

Figura I.12. Proteína RP2. Representação esquemática dos domínios funcionais CARP, TBCC e NDPk presentes na proteína RP2. Está também representada a sequência de resíduos de aminoácidos onde ocorrem as modificações pós-traducionais da proteína. Os resíduos sublinhados (G e C) sofrem miristoilação e palmitoilação, respectivamente, e são cruciais para a localização da proteína na membrana plasmática (Chapple et al., 2000).

A proteína RP2 (retinitis pigmentosa protein 2) humana é uma proteína expressa ubiquamente e constituída por 350 resíduos de aminoácidos. O gene X-linked retinitis pigmentosa (XLRP) codifica esta proteína e está implicado numa forma da doença retinite pigmentosa associada ao cromossoma X, caracterizada pela degeneração progressiva da retina resultando em cegueira. Este gene aparece mutado em aproximadamente 18% dos pacientes com XLRP. A

proteína RP2 está relacionada com o TBCC, uma vez que partilha com ele os domínios funcionais CARP e TBCC (figura I.12.), como referido anteriormente, sugerindo um possível papel na via de folding da tubulina. Esta relação entre as duas proteínas é suportada pela identificação de mutações pontuais patogénicas na RP2 em resíduos conservados com o TBCC (Chapple et al., 2000; Schwahn et al., 1998).

Na região C-terminal a RP2 apresenta um domínio NDPk (nucleoside diphosphate kinase) (figura I.12.), característico dos enzimas nucleotídeo-difosfato-cinases que estão envolvidos na transferência de grupos fosfato. No entanto, através de ensaios bioquímicos foi demonstrado que a RP2 não possui esta actividade, resultado que pode ser explicado pela ausência do resíduo de histidina essencial para a actividade enzimática. Contudo, a proteína RP2 apresenta uma capacidade de ligação ao DNA e uma actividade de exonuclease 3’-5’, função partilhada com a NDK1 humana. Estes resultados sugerem que a RP2 humana tenha um papel na reparação de danos do DNA (Yoon et al., 2006).

Estudos para determinar a localização celular da RP2 demonstraram que esta proteína se localiza na membrana plasmática e no citoplasma de células de mamífero, quer por imunofluorescência usando anticorpos gerados contra a proteína, quer através da expressão da proteína em fusão com proteínas fluorescentes (GFP). No entanto, a sua localização é variável dependendo da linha celular utilizada. A localização membranar da RP2 depende de modificações pós-traducionais, como a miristoilação e palmitoilação, num motivo presente na região N-terminal, uma vez que mutações nos resíduos Gly2 e Cys3, leva à perda desta localização pela proteína (figura I.12.) (Chapple et al., 2000; Schwahn et al.,2001). Através de uma análise filogenética observou-se que a proteína RP2 está apenas presente nos organismos que possuem cílios/flagelos (Stephan et al., 2007).

Dado que as proteínas RP2 e TBCC partilham o domínio funcional TBCC, foi testado se existiria uma partilha de funções entre as proteínas. Neste estudo verificou-se que ambas as proteínas estimulam a actividade GTPase da β-tubulina nativa, em cooperação com o TBCD. No entanto, apenas o TBCC participa na formação de novos heterodímeros de tubulina, não sendo a RP2 capaz de o substituir na via de folding da tubulina. Observou-se também que a mutação no único resíduo de arginina conservado entre a RP2 e o TBCC (Arg118 da RP2 e Arg262 no TBCC), identificada em pacientes com retinite pigmentosa, provoca uma perda total da actividade GAP em ambas as proteínas. Este resíduo de arginina é de extrema importância para a actividade das duas proteínas, uma vez que deverá constituir um dedo de arginina, característico das proteínas GAP (Bartolini et al., 2002).

A sobreposição de funções entre a RP2 e o TBCC foi também testada através de um ensaio de complementação em levedura, tendo sido verificado que tanto o TBCC como a RP2 são capazes de reverter parcialmente o fenótipo de sensibilidade ao benomil, agente despolimerizador de microtúbulos, provocado pela delecção do gene homólogo do TBCC, cin2. Assim, estes resultados indicam que as duas proteínas têm uma sobreposição de funções mas não são totalmente idênticas (Bartolini et al., 2002).

O mesmo estudo mostrou também que a proteína RP2 se liga à Arl3 (ADP ribosylation factor- like protein 3), que pertence à família as pequenas GTPases Arl, na qual se encontra inserida a Arl2, já referida anteriormente, sendo esta ligação dependente de GTP (Bartolini et al., 2002). A ligação entre as duas proteínas aumenta quando a RP2 não se encontra miristoilada. A proteína Arl3 foi identificada em estruturas de microtúbulos das células da retina e no cílio conector das células fotoreceptoras. No entanto, não foi identificada na membrana plasmática, sugerindo que este não é o local de interacção com a proteína RP2 (Grayson et al., 2002). Posteriormente, foi demonstrado que a proteína RP2 tem actividade GAP para a Arl3, sendo o resíduo de arginina conservado crucial para esta função (Veltel et al., 2008).

Estudos recentes sobre a localização da proteína RP2 em células fotoreceptoras demonstraram esta se co-localiza com a proteína centrina-3 e que se encontra no corpo basal do cílio conector, nos centríolos da base do cílio, na região peri-centriolar e no complexo de Golgi. A localização no corpo basal é dependente da miristoilaçao da RP2. Estas localizações sugerem um papel da proteína RP2 no tráfico peri-centriolar de vesículas e no transporte intraflagelar. Tanto o silenciamento da RP2 como da Arl3 através da técnica RNAi conduz a uma dispersão e fragmentação do complexo de Golgi e uma consequente diminuição do transporte vesicular deste organelo para o corpo basal do cílio. Estes dados sugerem que a regulação negativa da Arl3 pela RP2 é essencial para o tráfico de vesículas do complexo de Golgi para a base do cílio (Evans et al., 2010). Dada a localização da RP2 no cílio conector, foram desenvolvidos estudos em Trypanosoma brucei que comprovam este resultado, encontrando-se a proteína no corpo basal do flagelo. Foi também sugerido que a proteína RP2 poderia participar no mecanismo de controlo de qualidade da tubulina, actuando no corpo basal do flagelo (Stephan et al., 2007).