2.1. ANTIMICROBIANOS
Antimicrobianos são fármacos empregados no tratamento de doenças
infecciosas inviabilizando o crescimento dos micro-organismos nocivos, não
prejudicando o hospedeiro. A descoberta da penicilina em 1929 e sua posterior
inserção no tratamento de doenças infecciosas foi o marco inicial que culminou no
desenvolvimento dessa nova classe de fármacos. Hoje existe uma infinidade de
antimicrobianos disponíveis, que sistematicamente podem ser divididos em dois
subgrupos, aqueles que são sintetizados por procedimentos químicos em
laboratórios são chamados fármacos sintéticos, já os produzidos por bactérias ou
fungos são denominados antibióticos. Posteriormente, os antimicrobianos são
classificados em grupos de acordo com certas características pertinentes a seus
representantes, tais como suas estruturas químicas, mecanismos de ação e
espectros de atividade (TORTORA, FUNKE, CASE, 2000; LOPES, 2005).
O uso de antimicrobianos, entre os anos 2000 a 2010 atingiu um elevado
crescimento de 36% em escala global. Sendo que, 76% do aumento global do
consumo dessa classe medicamentosa correspondeu a Brasil, Rússia, Índia, China
e África do Sul, os chamados países do BRICS (BOECKEL, et al. 2014).
No âmbito de controlar o consumo desnecessário dessa classe de fármacos,
bem como evitar automedicação e surgimento de bactérias resistentes, no Brasil a
ANVISA implementou em 2010 a RDC 44/10, posteriormente revogada pela RDC
20/2011, que tornou obrigatória a venda de antibióticos apenas mediante a retenção
de receita. Posteriormente, complementar a essa resolução, passou a vigorar em 16
de abril de 2013 a prática de escrituração eletrônica dos antibióticos por parte de
todas as drogarias e farmácias do território nacional brasileiro, no Sistema Nacional
de Gerenciamento de Produtos Controlados (SNGPC). Processo semelhante que já
havia sido implementado realizado para psicotrópicos (portaria 344) há alguns anos
(BRASIL, 2011; BRASIL, 2013).
Essa medida se faz importante, pois o uso indiscriminado de antimicrobianos
induz ao surgimento de resistência bacteriana, que é uma resposta adaptativa
Objetivos
inevitável ao uso de antimicrobianos, pois esse processo de alteração de patógenos
suceptíveis por uma espécie mais resistente é uma resposta natural (FRENCH,
2005).
2.2. QUINOLONAS
As quinolonas são um gupo de antimicrobianos cujo mecanismo de ação
consiste na inibição de processos de transcrição e replicação do ácido
desoxirribonucléico (DNA) bacteriano. O uso dessa classe de antimicrobianos se
consolidou desde a década de 1960, quando em 1962 Lesher e colaboradores
descreveram o ácido nalidíxico, que foi introduzido na prática clínica. Antibióticos
quinolínicos tem como alvo a inibição da atividade da DNA girase ou topoisomerase
II, enzima essencial à sobrevivência bacteriana, pois a enzima DNA-girase é que se
encarrega de tornar a molécula de DNA compacta e biologicamente ativa. Ao inibir
essa enzima, a molécula de DNA passa a ocupar grande espaço no interior da
bactéria e suas extremidades livres causam a síntese descontrolada de RNA
mensageiro e de proteínas, determinando a morte das bactérias (BERGAN, 1988;
GOODMAN e GILMAN’S, 2006).
Quinolonas estão entre os antibióticos de maior uso nos últimos anos. A
classificação das quinolonas é dada em gerações de acordo com seu espectro de
ação, além de suas características farmacocinéticas. As quinolonas de primeira
geração (ácido nalidíxico) apresentam um espectro de ação limitado a bacilos
gram-negativos e, com isso, são utilizadas apenas para infecções do trato urinário. A
indrodução de um átomo de flúor na estrutura das quinolonas possibilitou o
surgimento das novas gerações capazes de apresentar melhor atividade
farmacocinética, que são as chamadas de fluoroquinolonas (WOLFSON e HOOPER,
1985; CALVO e MARTINEZ, 2009).
O surgimento das fluoroquinolonas nos anos 1980 possibilitou avanços
terapêuticos importantes, mais especificamente com o acréscimo de um átomo de
flúor na posição 6 do anel quinolínico, possibilitando aumento do espectro de ação e
melhor biodisponibilidade por via oral. Nesse momento surgiam as fluoroquinolonas
de segunda geração, como o norfloxacino (Figura 1). Com esse incremento na
Objetivos
atividade farmacocinética, a atividade contra bacilos gram-negativos foi melhorada,
porém ainda apresentando baixa atividade contra gram-positivos e anaeróbios,
como é o caso do norfloxacino. Já quinolonas de terceira geração, a exemplo do
levofloxacino (Figura 1), exibem maior atividade contra gram-positivos, além de
melhora em sua farmacocinética, o que viabilizou seu emprego sistêmico. As
quinolonas de quarta geração, a exemplo do gemifloxacino, mostram maior atividade
frente a bactérias gram-positivas e bactérias anaeróbias. Entretanto, algumas
espécies de bactérias tais como, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
e Mycobacterium tuberclosis são capazes de adquirir mutações que inviabilizem a
eficiência das fluoroquinolonas (ZHAO et al. 1997; HAYASHI; NAKATA; YAZAKI,
2004; CALVO e MARTINEZ, 2009).
Figura 1. Fórmula estrutural de norfloxacino e levofloxacino
.
Norfloxacino (A) Levofloxacino (B)
(A): ácido-etil-6-fluoro-4-oxo-1,4-dihidro-4-oxo-7-(1-piperacinil)-3-quinilonocarboxílico;
(B): (S)-(-)9-fluoro-2,3-di-hidro-3-metil-10-(4-metil-1-piperazinil)-7-oxo-7H-pirido[
1,2,3-de]-1,4-benzoxazina-6-carboxílico;
Tamanha a importância das quinolonas, especialmente quinolonas fluoradas,
fez com que as mesmas tivessem sido constantemente estudadas para se chegar a
aprimoramentos estruturais vidando melhoras terapêuticas pelo uso das mesmas.
Especialmente após a introdução do norfloxacino, diversas outras estruturas de
fluoroquinolonas surgiram na tentativa de aumentar o espectro geral antibacteriano,
melhorar absorção, permeação celular, biodisponibilidade, entre outros. Observa-se
inclusive, derivados de fluoroquinolonas capazes de apresentar potencial anticâncer
(BHANOT; SINGH; CHATTERJEE, 2001; RAJULU, G. G. et al. 2014).
Algumas dessas novas fluoroquinolonas apresentam modificações não
somente na estrutura básica anelar, mas também, possuem novas aminas cíclicas
Objetivos
ou heterocíclicos nitrogenados, apropriadamente substituídos na posição sete do
grupamento farmacóforo. No entanto, vale ressaltar que as posições indispensáveis
para a atividade biológica das fluoroquinolonas são a C-6 (contendo um átomo de
flúor), C-7 (contendo grupos piperazila e pirrolidina) e N-1 (contendo grupos etila,
ciclopropila, ter-butila e arilas fluorados) (BHANOT; SINGH; CHATTERJEE, 2001;
SOUZA et al., 2004).
Mesmo várias décadas após a descoberta classe de quinolonas, ainda hoje
seus representantes são de grande interesse terapêutico e econômico para a
indústria farmacêutica por se manterem eficientes contra vários antimicrobianos.
Com isso possuem prática clínica consolidada (do ponto de vista terapêutico), perfil
de impurezas (Tabela 1), vias de degradação e métodos analíticos quantitativos já
bem elucidados (do ponto de vista químico). Portanto, representantes dessa classe
de fármacos se mantêm em posição privilegiada para continuarem sendo estudados
nos mais diversos campos científicos (DEVI e CHANDRASEKHARB, 2009; USP,
2012).
Tabela 1. Exemplos de algumas impurezas conhecidas de levofloxacino e norfloxacino
Impurezas conhecidas de levofloxacino Impurezas conhecidas de norfloxacino
Fórmula estrutural Fórmula molécular Fórmula estrutural Fórmula molécular
O N O OH O F F(1)
C
13H
9F
2NO
4N
O
OH
O
F
Cl
(4)
C
12H
9ClFNO
3 N O O N N F(2)
C
17H
20FN
3O
2 N O N HN F(5)
C
15H
18FN
3O
O N O OH O N N -O F(3)
C
18H
20FN
3O
5 N O HO N N O F O(6)
C
17H
18FN
3O
4Objetivos
2.3. ESTUDO DE ESTABILIDADE
Estudos de estabilidade são realizados afim de se avaliar a manutenção das
características químicas, físicas, microbiológicas, terapêuticas e toxicológicas de
determinada especialidade farmacêutica, determinando assim, seu prazo de
validade. Sendo o prazo de validade o tempo limite para que o produto farmacêutico
apresente-se apto ao uso, este é determinado com base em estudos de
estabilidade, que vão atestar as características dos produtos farmacêuticos
estabelecendo ou confirmando seu prazo de validade. Os testes de estabilidade
determinam tal prazo, baseando-se também no período temporal compreendido
entre a fabricação do produto farmacêutico até o momento em que sua potência não
seja inferior a 90% e os produtos de alteração, caso presentes, estejam
devidamente identificados, quantificados e qualificados (BRASIL, 2005; ALLEN JR.,
POPOVICH e ANSEL, 2007; BRASIL, 2013).
Além disso, a etapa de desenvolvimento e pré-formulação conta com estudos
de estabilidade para aperfeiçoar a disposição dos excipientes propostos juntamente
com o princípio ativo, evitando incompatibilidade de atividades com base em suas
propriedades físicas e químicas, tais como forma cristalina ou polimórfica individual,
tamanho da partícula e presença de água. A avaliação de possíveis interações entre
produto e materiais de embalagem também são determinadas devido aos estudos
de estabilidade, sendo possível identificar alterações químicas que podem acarretar
modificação em nível físico ou químico entre componentes de embalagem e
formulação (LACHMAN, LIEBERMAN e KANIG, 2001; KLICK et al. 2005).
Estudos de estabilidade podem ser realizados de três formas, são eles os
estudos de estabilidade acelerado, de longa duração e de acompanhamento. O
estudo de estabilidade acelerado (em temperaturas e umidade elevadas) é projetado
para acelerar a degradação química e/ou mudanças físicas no produto, a fim de
simular o impacto de curtas exposições a condições drásticas de armazenamento,
fato que pode ser observado ao longo do transporte. Esse estudo pode simular o
que ocorreria com o produto farmacêutico em condições normais de armazenamento
por longos períodos de tempo. Para tanto, a realização de estudos de estabilidade
acelerada conta com produtos farmacêuticos submetidos a condições de 40°C ± 2ºC
Objetivos
e 75% ± 5% UR (umidade relativa), fato que possibilita acelerar possíveis
degradações intrínsecas do fármaco (BRASIL, 2005).
O estudo de estabilidade de longa duração é projetado em condições de
temperatura e umidade menos elevadas que os estudos de estabilidade acelerada,
30°C ± 2ºC e 75% ± 5% UR, para países que se enquadrem na classificação
climática de clima quente e úmido, como é o caso do Brasil. Estudos de estabilidade
de longa duração são utilizados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e
recomendar as condições de armazenamento do produto. Por fim, os estudos de
estabilidade de acompanhamento são realizados a fim de garantir se o medicamento
mantém o padrão de qualidade verificado nos estudos de estabilidade de longa
duração (BRASIL, 2005).
Para se considerar um produto farmacêutico estável, não basta simplesmente
considerar sua potência para assegurar que o mesmo mantenha suas
características e resposta farmacológica, mas deve-se controlar também a presença
de Produtos de Degradação (PD) e outras impurezas, que podem afetar a atividade
terapêutica do medicamento. Logo, deve-se monitorar o aparecimento destes
compostos nos medicamentos acabados ou nos fármacos, visto que sua presença é
praticamente inevitável. Para tanto, deve-se ter total conhecimento da estrutura
química, propriedades físicas e químicas, processos de isolamento e purificação do
PD no produto acabado (ICH, 2003b; CARVALHO et al. 2005; RAO, et al., 2010).
Ao longo da realização dos estudos de estabilidade se pode concluir que um
determinado produto farmacêutico acabado (PFA) realmente conserva-se dentro dos
limites de teor e de produto de degradação por meio de métodos analíticos
específicos ao fármaco de interesse, sendo indispensável que os testes sejam
capazes de avaliar a presença ou formação qualitativa e quantitativa de produtos de
degradação de forma rápida, fornecendo resultados precisos e reprodutíveis. Caso a
metodologia empregada ser por cromatografia, aconselha-se ainda emprego de
detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas, que são capazes de
assegurar a pureza dos picos cromatográficos referentes as substâncias de
interesse de modo específico e seletivo, portanto sem interferentes. Médodos que
sigam essa regra são conhecidos como metodologias indicativas de estabilidade
(SINGH e BAKSHI, 2002; BRASIL, 2003; BRASIL 2013).
Objetivos
Para controle de produtos de degradação de fármacos, testes específicos
para os mesmos devem ser adotados. Caso as impurezas ou produtos de
degradação não estejam disponíveis, deve-se adotar procedimentos que envolvam
testes de estresse em condições variadas. Assim, os estudos de degradação
forçada devem promover degradação em extensão suficiente a fim de permitir
avaliação da formação de PD e sem que haja degradação completa da molécula de
interesse farmacológico (BRASIL, 2013).
2.4. PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO
Impurezas podem ser conceituadas como substâncias que apresentem
potencial de contaminação. A impureza pode ainda ser definida como uma
substância de interesse misturada ou impregnada em outra substância estranha ou
de qualidade inferior. Em outras palavras, impurezas são caracterizadas como todos
os componentes presentes no insumo farmacêutico ou no produto farmacêutico
acabado que não sejam princípio ativo nem excipientes (ICH, 1999; AHUJA, 2007).
As impurezas são oriundas de vias orgânicas e inorgânicas. Classificam-se
como impurezas inorgânicas, metais pesados, catalisadores, entre outros
componentes que tenham sido utilizados na via de síntese do próprio fármaco.
Quando se refere à impurezas orgânicas, trata-se de substâncias correlatas ao
insumo ativo, sejam elas produtos intermediários, subprodutos, substâncias
relacionadas ou PD, podendo essas impurezas ser originárias das mais variadas
vias, tais como síntese, estocagem inadequada, e no PFA, podem advir desde a
produção até do seu próprio envelhecimento (RAO et al., 2010).
Já os produtos de degradação presentes no produto acabado, geralmente
surgem de condições de transporte e estocagem do medicamento. Especificamente,
tratam-se de alterações na pureza do PFA que são mediadas por efeitos de
mudanças na temperatura, umidade, pH, ou ainda de características intrínsecas do
insumo ativo, bem como de interações na formulação entre insumos ativos e
excipientes, forma farmacêutica e propriedades dos materiais de embalagem
primária (BRASIL, 2005).
Objetivos
2.5. ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA
Estudos de degradação forçada ou testes de estresse são importantes para
determinar a estabilidade de um fármaco, elucidar suas principais rotas de
degradação, além de monitorar seus possíveis produtos de degradação. Os testes
de degradação forçada visam, portanto, simular condições extremas de estresse que
o produto farmacêutico venha a enfrentar, tanto para o insumo ativo como para as
variadas formas farmacêuticas de PFA (ICH, 2003; ICH, 2006).
Testes de estresse são essenciais nas pesquisas de identificação de
possíveis PD, propiciando que as principais vias de degradação de determinado
princípio ativo sejam determinadas. Os testes de estresse devem obrigatoriamente
ser mais extremos que as condições apresentadas nos estudos de estabilidade
acelerados. A exemplo disso, tem-se métodos de degradação forçada
proporcionados por altas temperaturas, diversas faixas de pH, oxidação, metais
pesados e fotólise. Contudo, avaliar alguns dos possíveis produtos de degradação
formados sob tais condições talvez não seja necessário uma vez que se prove que
os mesmos não sejam formados sob condições de estabilidade acelerada ou de
longa duração (ICH, 2003; BRASIL, 2013).
Testes de degradação forçada são recomendados, ainda, para casos em que
se pretende avaliar impurezas ou apenas PD de determinados fármacos e tais
impurezas não estejam disponíveis. Neste momento os estudos de degradação
forçada podem ser realizados desde que abordem procedimentos bem
caracterizados (ICH, 1994; BRASIL, 2003).
A natureza dos testes de estresse de fármacos depende diretamente do
fármaco em questão e tendem a variar amplamente de acordo com sua estabilidade
inerente do fármaco. Para tanto alguns dos principais guias, tais como o
International Conference on Harmonization (ICH) já recomendam condições iniciais
de estresse, tais como aquecimento com incremento de 10°C a partir da condição de
estabilidade acelerada (50°C, 60°C, etc.). Entretanto existem condições estressantes
bastante distintas entre si, a exemplo de algumas regiões que adotam como estudo
de estresse o simples uso das mesmas condições de estabilidade acelerada
(40°C/75% UR) e até outros casos com condições mais extemas, como o uso de 5 –
Objetivos
10°C abaixo da temperatura de fusão do fármaco. Embora exista uma infinidade de
recomendações a cerca da condução de estudos de estresse, pode-se observar
guias validados e mundialmente respeitados que dispontam como referência nesse
campo, como o ICH (ICH, 2003; REPUBLIC OF KENYA, 2010; ASEAN, 2012).
Condições catalíticas por faixas extremas de pH buscam induzir hidrólise na
molécula do fármaco. Para essa técnica uma condição inicial pode partir do uso de
ácido clorídrico 0,1 mol L
-1como condição hidrolítica ácida e hidróxido de sódio 0,1
mol L
-1como condição hidrolítica alcalina. A indução a degradação pela ação de luz
trata-se de uma condição também indispensável, pois possibilita avaliar a
fotosensibilidade de determinado fármaco, sendo ainda, indispensável para definir
condições de estocagem do fármaco e do PFA. Esse estudo de estresse pode ser
conduzido a princípio pelo fármaco isolado e/ou em solução simples ou em
suspensão, sendo recomendada uma exposição a 1,2 milhões de lux por hora
emitida por fontes de luz fluorescente. Para o estudo de degradação oxidativa
observa-se uso amplo de peróxido de hidrogênio (0,02 – 3,0%) como agente
estressante, além de azobisisobutironitrila (AIBN) e hidrocloreto de
2,2'-azobis(2-amidinopropano) (AAPH), por exemplo, que são agentes oxidantes mais seletivos.
Metais como cobre e ferro também podem ser usados como agentes indutores de
oxidação em estudos de estresse (ICH, 1996; ICH, 2003; OMS, 2009; ALSANTE, et
al. 2007).
Em relação a gama de materiais empregados na realização de testes de
estresse, as possibilidades são diversas. O primeiro material é o recipiente onde
ocorrerá a condição de estresse, de modo que o vidro destaca-se por ser tratar de
material inerte. Diversos materiais tais como frascos, tubos, ampolas, entre outros
podem ser usados e devem sempre se apresentar devidamente vedados.
Geralmente opta-se pelo uso de estudos de degradação forçada em solução, onde
os volumes usados podem chegar até a 100 mL e as concentrações de fármacos
normalmente usadas são de até 10 mg mL
-1(SINGH e BAKSHI, 2000).
Um segundo material de destaque em estudos de estresse consiste no
equipamento para criar determinada condição de estresse. Pode-se optar pela
realização de estudos de degradação forçada à temperatura ambiente, mas quando
se pretende acelerar a degradação, parte-se para técnicas de aquecimento tais
Objetivos
como banhos termostatizados de água, que ajudam no fornecimento de altas
temperaturas às amostras a serem estressadas, ou ainda, banhos de óleo e refluxo,
quando testes de estresse requerem temperaturas mais elevadas (superiores a
80°C). Independente da condição catalítica escolhida, sempre é necessário manter
um controle rígido da temperatura reacional com auxílio de termômetros
devidamente calibrados (SINGH e BAKSHI, 2000; JUNWAL, et al. 2012).
Dessa forma, cuidados com monitoramento da temperatura são importantes
tanto para se assegurar quais variáveis juntas geram situação de estresse além de
garantir que a condução de estudos de estresse se dê de maneira segura. Essa
preocupação ganha campo especialmente quando se opta por utilizar fornos de
convecção ou câmaras de aquecimento para aquecer amostras, pois nesses casos,
cuidados com temperatura reacional devem ser redobrados, já que propiciam maior
incidência de acidentes no ambiente laboratorial caso amostras aquecidas estourem
no interior dos fornos (SINGH e BAKSHI, 2000).
Ao longo da realização de ensaios de degradação forçada é importante
salientar que não basta apenas estressar o fármaco e/ou o PFA de maneira
descontrolada visando apenas formar produtos de degradação. É necessário saber
quando a degradação atinge um limite satisfatório, o que indica o término do estudo
de estresse. Caso os estudos de estresse persistam por longos períodos de tempo,
os produtos de degradação formados podem sofrer novas clivagens originando
compostos secundários, o que não é o intuito dos estudos de degradação forçada,
uma vez que um PFA dificilmente encontra condições tão severas no
armazenamento quando está prestes a ser destinado ao uso (OMS, 2009).
Assim, orienta-se que em tais estudos atinjam em torno de 10 a 30% de
degradação em relação a concentração inicial de fármaco não degradado. Isso faz
com que cada teste de estresse siga condições particulares de acordo com a
susceptibilidade do fármaco a sofrer ou não degradação nas mais diversas
condições de estresse (OMS, 2009).
Para se avaliar os resultados do estudo de degradação forçada, técnicas
cromatográficas como cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e
cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE) são bastante populares por
possibilitarem boa separação entre fármaco e PD formados no estudo de estresse.
Objetivos
Para tanto, a metodologia cromatográfica deve ser capaz de validar a
especificidade/seletividade para determinados compostos, por exemplo, por seu
acoplamento a detectores com arranjo de diodos e espectro de massas, que são
capazes de monitorar purezas cromatográficas. Assim pode-se confirmar se o
método em questão seja efetivo ou não na função de medir determinado composto
(fármaco ou produto de degradação) sem presença de interferentes (SINGH e
BAKSHI, 2002; ICH, 2003; USP, 2012).
2.6. FATORES ATUANTES NA DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS
A estabilidade de uma especialidade farmacêutica é dependente de fatores
ambientais como temperatura, umidade, luz e de fatores diretamente relacionados
ao próprio produto como propriedades físicas e químicas, de substâncias ativas e
excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica, processo de fabricação e
propriedades dos materiais de embalagens (BRASIL, 2005).
2.6.1. Temperatura
A temperatura é um fator que influencia a velocidade de reações, portanto
análises que empreguem termodegradação são úteis para avaliação da estabilidade
térmica (ATKINS, 1999). Por essa via de degradação destacam-se alterações que
podem ocorrer na estrutura da molécula por reações de descarboxilação, hidrólise e
rearranjos, por exemplo (BAERTSCHI et al., 2005).
Em se tratando de fármacos, sua degradação pode ser aumentada com o
aumento da temperatura, de modo que a cada aumento de 10°C aumenta-se em
média de duas a três vezes a velocidade da reação (nesse caso, reações de
degradação). Algumas reações não são afetadas significamente quando ocorre uma
variação da ordem de 10°C enquanto que outras apresentam alterações
significativas. E, ainda, quando se pretende conduzir estudos de degradação
forçada, sugere-se que o intervalo de temperatura em que amostras são submetidas
varie de 40° C a 110° C e, o período de exposição de poucos minutos a meses
Objetivos
(SINGH e BAKSHI, 2000; LACHMAN, LIEBERMAN e KANIG, 2001; ALSANTE, et al.
2007).
2.6.2. Hidrólise
Quando se considera mecanismos de degradação, a água é avaliada como
No documento
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO FORÇADA DE FÁRMACOS FLUOROQUINOLÍNICOS ASSISTIDA POR IRRADIAÇÃO MICRO-ONDAS
(páginas 17-35)