Riqueza e diversidade bacteriana nos microcosmos

A riqueza e a diversidade da comunidade bacteriana presente nos microcosmos foram avaliadas pela ferramenta computacional QIIME, com base nos dados gerados pelo sequenciamento da região V3-V4 do gene RNAr 16S. As análises se deram de duas formas:

1) Comparando-se os microcosmos enriquecidos com lignina dos dias 9, 18 e 27 com o microcosmo controle do início (solo nativo, sem adição de lignina); e

2) Comparando-se os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e

enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) existentes para um mesmo dia de amostragem.

Para a primeira forma, os dados de riqueza e diversidade são apresentados comparando os microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 com o microcosmo controle do início da amostragem, com solo nativo (original) e sem adição de lignina. Nesta forma, foram calculadas as diversidades alfa e beta dos microcosmos, avaliando de que modo se

deu o impacto da ação da lignina ao longo do tempo, ou em outras palavras, quais

características foram preservadas, transformadas ou eliminadas nos microcosmos enriquecidos com lignina em relação ao microcosmo controle inicial (sem adição de lignina). Já para a segunda forma, os dados são apresentados comparando-se, para um mesmo dia de amostragem (9º, 18º ou 27º), os microcosmos controles com os enriquecidos destes dias. Excetuaram-se desta comparação os microcosmos controles (solo nativo, sem adição de lignina) do início com os microcosmos recém-enriquecidos com lignina do primeiro dia, uma vez que se partiu da premissa que a adição da lignina não causaria diferenças ecológicas instantâneas e estatisticamente significativas à comunidade bacteriana presente no solo. Em conta disso, os microcosmos “enriquecidos” do dia 0 (início) foram descartados. Preferiu-se também agrupar as triplicatas de cada condição (controle e enriquecido) de cada dia de amostragem, para melhor visualização dos resultados. Assim, levando-se em conta os dados

do sequenciamento da primeira forma, foi obtido um total de 419.418 sequências de alta qualidade, sendo reconhecidas 36.439 OTUs deste valor (Tabela 5).

Tabela 5. Número de sequências e diversidade das comunidades bacterianas dos microcosmos do

ínicio e subsequentes dias de enriquecimento.

Início 9º dia com

lignina 18º dia com lignina 27º dia com lignina Número de sequências 99701 90001 122902 106814 OTUs observados 19955 18673 11379 11405 Estimador Chao (0.03) 23667 20815 12797 11425 Índice de Shannon 11,52 11,09 7,88 7,86

Os resultados calculados mostraram valores de riqueza e diversidade maiores que os encontrados na literatura para solo de rizosfera (GREMION, 2003) e da mata atlântica brasileira (FAORO, 2010; BRUCE, 2010), embora estes trabalhos não tenham sido feitos por sequenciamento em larga escala, como Illumina (caso deste trabalho de mestrado). No entanto, nota-se que do início ao último dia de enriquecimento a quantidade de OTUs presente na comunidade bacteriana dos microcosmos decaiu de 19.955 OTUs para 11.405 (Figura 23), ocorrendo uma queda expressiva do 9º ao 18º dia. Pode-se dizer que a lignina desempenhou um papel predominantemente negativo sobre a riqueza da comunidade bacteriana, inibindo o crescimento e/ou a sobrevivência da maioria dos grupos taxonômicos originais. Embora os valores do índice de diversidade tenham se mostrados mais altos que outros reportados na literatura para solos Os resultados levantados mostraram, também, que houve considerável redução na diversidade da comunidade bacteriana sob efeito da lignina ao longo do tempo, queda expressa pelo Índice de Shannon (Tabela 5). Os dados mostram que os dois primeiros dias de amostragem (início e 9º dia) apresentam valores de diversidade muito similares entre si (~11), sendo posteriormente reduzidos para aproximadamente 7,8 nos dois últimos dias (18º e 27º). Esta redução na diversidade, acompanhada ao mesmo tempo pela redução na quantidade de OTUs ao longo do tempo, é um forte indício de que a comunidade bacteriana sofreu uma grande perturbação em sua biodiversidade e estrutura. O impacto de uma perturbação biótica ou abiótica dependerá de sua freqüência e intensidade com que a mesma ocorre ou ocorreu (WILKINSON, 2002). No caso dos fatores bióticos, a interação entre os microrganismos do meio (solo) do qual este está confinado (microcosmo) pode se dar por

competição pelo mesmo substrato ou fonte de energia, acarretando uma redução na viabilidade ou taxa de natalidade de certos grupos e possível desparecimento de funções ecologicamente importantes ao equilíbrio de um ecossistema (caso não haja mais de uma espécie desempenhando papéis ecologicamente redundantes). Já abioticamente estes fatores podem estar restritos à oxidação química de minerais do solo importantes para o metabolismo bacteriano ou mesmo à diversificação local de condições ambientais, influenciando a disponibilidade de nutrientes em micro-hábitats (heterogeneidade espacial de recursos). A alteração nas condições ambientais de um (micro) ecossistema pode representar um tipo de perturbação à sua comunidade biótica, exercendo pressão seletiva sobre ela (CALBRIX, 2005). No caso do enriquecimento, o input de lignina nos microcosmos significou um estresse abiótico considerável na estrutura e abundância da comunidade bacteriana ali presente, propiciando a preponderância de micro-organismos que tolerarassem ou minimizassem as pressões seletivas ao longo do tempo (FIERER et al., 2010).

Figura 23. Riqueza nos microcosmos ao longo do enriquecimento. O gráfico mostra a quantidade

de OTUs presentes nos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e no microcosmo controle do primeiro dia (solo nativo; sem adição de lignina).

Para avaliar como a lignina interferiu na diversidade da comunidade bacteriana, foram aplicados dois conceitos de cálculo de diversidade: a diversidade alfa (α) e a diversidade beta (β). Enquanto a diversidade alfa se limita a calcular a diversidade em uma mesma amostra/microcosmo, a diversidade beta compara a diversidade entre duas ou mais amostras/microcosmos, indicando quais delas são mais similares ou distintas entre si.

A riqueza e a diversidade de organismos em uma comunidade são estritamente dependentes do esforço amostral realizado, tendo em vista que o número de OTUs tende a

aumentar à medida que a quantidade de sequências-marcadoras (no caso, o gene RNAr 16S) são analisadas. Neste sentido, medidas que estimem a riqueza (número de espécies ou OTUs) permitem avaliar o quanto os dados amostrais representam a riqueza presente no ambiente, além de oferecer também dados mais consistentes na realização de analogias ou estudos comparativos entre comunidades. Tais medidas podem ser dadas através de curvas de acumulação ou estimadores de riqueza. Nesse contexto, foram aplicadas curvas de acumulação e o estimador de riqueza Chao1 para cada comunidade de microcosmo, adotando um tamanho amostral (número de sequências/OTUs) padrão. A seguir, são apresentadas as quantidades de OTUs em função do número de sequências analisadas (curva de acumulação, Figuras 25 e 25) e a estimativa da riqueza das comunidades através do método não- paramétrico Chao1 (Figuras 26 e 27).

Figura 24. Curva de rarefação mostrando o número de OTUs observado em função do número de sequencias do gene RNAr 16S analisadas a partir dos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e do microcosmo controle (solo nativo). Painel (A): triplicatas das amostras foram analisadas

individualmente; Painel (B): triplicatas das amostras foram agrupadas antes da análise.

Os gráficos da Figura 24 mostram a significativa diferença entre o número de OTUs dos dois primeiros dias (início e 9º dia) e dos dois últimos (18º e 27º dias), à medida que o número de sequências analisadas e o tempo de exposição à lignina aumentam. Tal resultado reforça a hipótese que a lignina influencia negativamente a riqueza bacteriana de uma comunidade ao longo do tempo, mesmo que o input da mesma tenha se dado apenas uma única vez no início do enriquecimento. Apesar da concentração de lignina (10% m/m) adicionada ao microcosmo não ser comum em meios naturais, e a mesma corresponder a uma forma prontamente disponível (lignin-alkali em pó), a diminuição no número de OTUs indica que a maioria das bactérias que habitam o solo possivelmente não detém mecanismos capazes de biodegradar, detoxificar ou tolerar a lignina quando em contato com as suas células, levando à seleção de alguns grupos microbianos em detrimento de outros.

Por outro lado, os valores de riqueza observados nos microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) foram comparados entre si para cada dia de amostragem, cujos dados são expressos na Figura 25.

Figura 25. Curva de rarefação mostrando o número de OTUs observado em função do número de sequencias do gene RNAr 16S analisadas, comparando os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem. As linhas

tracejadas mostram maior diferença na riqueza encontrada entre os microcosmos controles e enriquecidos dos 18º e 27º dias de amostragem.

É possível notar que, para praticamente qualquer quantidade de sequências analisadas (principalmente a partir de aproximadamente 25.000), a quantidade de OTUs na condição controle é sempre maior que na condição enriquecida. Isto evidencia que a adição de lignina impactou a comunidade bacteriana ao longo do tempo, sendo a menor diferença encontrada no 9º dia e a maior no 27º dia (os microcosmos controles têm quase o dobro de OTUs em relação aos enriquecidos, para mais de 60.000 sequências analisadas).

Os resultados obtidos pelo método não-paramétrico Chao1 corroboraram os resultados observados nas curvas de rarefação. Os números de OTUs dos dois primeiros dias de amostragem (início e 9º dia) são menores do que dos dois últimos dias (18º e 27º dias), indicando novamente o impacto negativo da lignina sobre a riqueza da comunidade bacteriana ao longo do tempo (Figura 26).

Figura 26. Estimativa de riqueza pelo método não-paramétrico Chao 1, comparando-se os microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 com o início (solo nativo). Número de OTUs

estimado em função da quantidade de sequências do gene RNAr 16S analisadas, para as triplicatas analisadas individualmente (A), ou com suas triplicatas agrupadas (B).

Assim como realizado na análise da riqueza observada, a estimativa de riqueza pelo método Chao1 também comparou os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem (Figura 27). Do mesmo modo, maiores diferenças na estimativa de riqueza também foram encontradas entre os microcosmos controles e enriquecidos à medida que o tempo de exposição à lignina aumenta, ou seja, nos 18º e 27º dias de amostragem.

Figura 27. Estimativa de riqueza pelo método não-paramétrico Chao 1, comparando os microcosmos

controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem. As linhas tracejadas mostram maior diferença na riqueza estimada entre os microcosmos controles e enriquecidos do 18º e 27º dias de amostragem.

A Figura 27 mostra que, para praticamente qualquer quantidade de sequências analisadas (principalmente a partir de aproximadamente 25.000), a quantidade de OTUs na condição controle é sempre maior que na condição enriquecida. Isto corrobora novamente com a tese que a adição da lignina aos microcosmos impactou negativamente a riqueza da comunidade bacteriana nativa do solo da Caatinga ao longo do tempo, reduzindo sua riqueza no final para praticamente à metade do seu valor inicial. No entanto, uma vez que qualquer distúrbio possui a capacidade de modificar o tamanho de uma comunidade, diminuindo o número de indivíduos (OTUs) e a frequência como os mesmos são aleatoriamente amostrados (PETRAITIS, 1989; MYERS et al., 2015), é necessário avaliar como a composição da mesma foi afetada nos vários microcosmos, o que pode ser feito pelo cálculo da diversidade beta.

Uma perturbação, como a adição de lignina ao microcosmo, poderia aumentar a convergência de espécies mais tolerantes ou causar divergência na composição de comunidades através da formação de gradientes ambientais, que poderiam ser criados após a introdução da lignina no habitat em questão (MYERS et al., 2015). Por conta disso, a dissimilaridade na composição taxonômica entre as duas situações de estudo (controle e adição de lignina) é bem explorada pela diversidade beta, dado que a heterogeneidade ambiental entre ambas se evidencia principalmente pela quantidade de lignina adicionada inicialmente ao microcosmo.

Nesse contexto, a diversidade beta entre todas as comunidades bacterianas dos microcosmos/dias de enriquecimento foi calculada pela ferramenta QIIME, determinando-se as distâncias entre os pontos de amostragem através do método UniFrac. A análise das coordenadas principais (PCoA) foi realizada tanto na forma weighted (ponderada) quanto

unweighted (não ponderada), ambos representados pela ferramenta de visualização Emperor,

integrada ao QIIME. A principal diferença entre a forma ponderada e não ponderada baseia-se na inclusão da abundância de OTUs no cálculo das distâncias entre as comunidades. Enquanto a forma não ponderada (unweighted) toma todas as OTUs dos grupos em níveis iguais de abundância, a forma ponderada (weighted) considera as OTUs de cada grupo com seus específicos níveis de abundância nas comunidades, sendo assim mais coerente para estudos biológicos, e a escolhida para representação (Figuras 28 e 29). Assim como nos gráficos de alfa-diversidade, estão representados os microcosmos de forma individual (triplicatas separadas) e com as triplicatas agrupadas, bem como a comparação dos mesmos em diferentes condições para cada dia de amostragem.

Figura 28. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) da diversidade beta (via PCoA-UniFrac) entre

as comunidades bacterianas dos microcosmos enriquecidos dos dias 9, 18 e 27 e início (solo nativo) utilizando a ferramenta Unifrac ponderada (weighted). Painel (A): triplicatas das amostras foram analisadas individualmente, Painel (B): triplicatas analisadas de maneira agrupada.

Na Figura 28, pode-se observar considerável distância entre os pontos pertencentes a aparentemente dois grupos distintos: um abrangendo as amostras relativas ao início e 9º dia de enriquecimento com lignina (dias iniciais) e outro abrangendo as amostras relativas aos 18º e 27º dias de enriquecimento (dias finais). O grau de dissimilaridade entre os dois grupos pode ser verificado pela distância entre os seus pontos representantes, sendo mais expressiva quando as triplicatas das amostras são analisadas de maneira agrupada (Figura 28B). Destes resultados, podemos deduzir que do início ao 9º dia com lignina a comunidade bacteriana não teve alterações significativas em sua estrutura e diversidade.

A diversidade beta (via PCoA-weighted-UniFrac) da comunidade bacteriana entre os microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem também foi calculada e analisada, cujos resultados estão mostrados na Figura 29.

Figura 29. Análise de Coordenadas Principais (PCoA) da diversidade beta (via PCoA-UniFrac) entre

as comunidades bacterianas dos microcosmos controles (início, 9º, 18º e 27º dias) e enriquecidos (9º, 18º e 27º dias) para cada dia de amostragem utilizando a ferramenta Unifrac ponderada (weighted).

Na Figura 29, percebe-se que há a formação de três grupos distintos, dos quais o primeiro consiste das amostras relativas ao início + 9º dia de solo enriquecido; o segundo engloba as amostras relativas ao 9º dia de solo sem lignina + 18º dia de solo sem lignina +

27º dia de solo sem lignina, e o terceiro grupo engloba as amostras relativas ao 18º dia de solo com lignina + 27º dia de solo com lignina. Estes resultados sugerem que do início ao 9º

dia com lignina não houve alterações significativas na estrutura e diversidade da comunidade bacteriana. Ainda, a comunidade bacteriana dos microcosmos sem lignina parecem ter se diferenciado relativamente da comunidade inicial, mantendo-se constante depois nos 9º, 18º e

27º dias, isto é, não apresentarando relevantes diferenças na diversidade bacteriana entre si. Já o terceiro grupo (microcosmos enriquecidos dos dois últimos dias de amostragem) se mostra bastante disperso em relação aos demais, sugerindo uma diferenciação mais profunda na comunidade bacteriana em relação ao início do experimento e em relação aos microcosmos sem lignina. Isto se deu provavelmente em função da pressão seletiva exercida pela lignina, que favoreceu apenas grupos de bactérias capazes de tolerar e/ou utilizar a lignina como fonte de carbono, partilhando, assim, poucas características em comum com o início do enriquecimento.

De maneira geral, é possível observar que houve duas situações distintas às quais a comunidade bacteriana presente no microcosmo esteve sujeita: uma relativa ao início do enriquecimento e outra ao final, estágio pelo qual os efeitos da lignina já são mais intensos. Além da própria heterogeneidade na composição taxonômica existente entre os microcosmos, a diversidade beta mostra alterações na microbiota ao longo do tempo, resultantes principalmente da ação da lignina e esgotamento nutricional do ecossistema, dado que a troca de componentes dos microcosmos com o meio externo é praticamente nula.

O diagrama de Venn mostra o número de OTUs exclusivas e compartilhadas entre os microcosmos enriquecidos dos diferentes pontos de amostragem (Figura 30).

Figura 30. Diagrama de Venn mostrando as OTUs exclusivas e compartilhadas entre as comunidades

Na Figura 30 é possível notar que 4684 OTUs são unicamente exclusivas ao primeiro dia de amostragem (início), ao passo que apenas 1883 OTUs são exclusivas ao último dia de amostragem (27º dia). Isto não significa que tais OTUs não estavam presentes nos outros dias anteriores, mas que possivelmente a abundância destas na comunidade bacteriana aumentou significativamente ao longo do enriquecimento, permitindo sua detecção ao final do experimento através do sequenciamento Illumina.

Outra observação que merece destaque é que das 19.995 OTUs existentes no primeiro dia de amostragem (Figura 23), 953 (Figura 30) permaneceram até o 27º e último dia de enriquecimento, sendo a maioria (~95,2%) erradicada pela exposição à lignina ao longo do tempo. No entanto, apesar da lignina ter exercido um papel devastador na riqueza da comunidade, nem todos os grupos taxonômicos bacterianos sofreram impacto negativo em sua abundância na comunidade. Muitos deles não só sobreviveram ou toleraram a influência da lignina ao longo do tempo, mas sim se beneficiaram após o input da mesma nos microcosmos, como detalhado a seguir.