Essas dificuldades na síntese, portanto, impactaram negativamente no planejamento dos estudos de atividade anti-inflamatória, principalmente com relação às quantidades disponíveis dos compostos.
com a possibilidade de obtermos derivados ainda mais potentes, que este trabalho de dissertação de mestrado foi proposto, com os seguintes objetivos:
1. Revisitar a sequência estabelecida para a síntese das ciclopentenonas
dissubstituídas 1-4 e propor uma nova sequência sintética mais simples, direta e geral para a preparação das substâncias-alvo;
2. Utilizar essa abordagem sintética para preparar novos derivados; 3. Identificar derivados com maior potencial anti-inflamatório.
3. Planejamento de Potenciais Ant-inflamatórios
No trabalho de doutorado precedente22, a estratégia de modificação molecular consistiu de bioisosterismo clássico, a partir dos anti-inflamatórios desenvolvidos pela Merck (ver Figura 4). Nessa estratégia, o átomo de oxigênio espaçador da molécula protótipo 4b (Figura 4) foi substituído pelo espaçador metileno, agora posicionado no Cβ. Em Cβ, o objetivo foi também de posicionar o substituinte fenila, sempre p- substituído, no bolsão da COX-2, sítio de ligação seletivo da enzima. Quanto aos substituintes dos anéis aromáticos, variações foram realizadas a fim de estudar principalmente o papel do flúor, em diferentes posições, na formação de ligações de hidrogênio. Sendo pequeno, mas de alta polaridade, o interesse foi de comparar essas substituições àquelas dos átomos de oxigênio (ver Figura 5).
Uma vez que no trabalho precente22 as ciclopentenonas com substituição 3,5- F no anel aromático em posição α à carbonila apresentaram bons perfis anti- inflamatórios, como ponto de partida selecionamos esse padrão de substituição para compor os novos modelos do nosso trabalho. Para avaliar a influência da natureza dos substituintes do anel aromático em R2 (em posição β à carbonila), por sua vez, utilizamos a molécula de Celecoxib (Celebra®) como referência. Apesar do VIOXX® possuir maior similaridade estrutural às ciclopentenonas, as ciclopentenonas dissubstituídas que foram desenvolvidas pela Merck apresentaram perfil inibitório sobre a COX-2 melhor que deste fármaco20 e, no trabalho de doutorado precedente, próximo do Celecoxib.22 Além disso, no momento, o Celecoxib é o único disponível no mercado, com menos restrições por órgãos regulamentadores do que o VIOXX®. Em virtude disso, estudos atuais sobre os AINEs, e publicados em revistas de elevados fatores impacto, tomam como referência o Celecoxib.18
Para este fármaco encontramos valores de IC50 para a COX-1 e para a COX- 2 de substituintes em sua estrutura na posição X (Tabela 1).23 O IC50 representa a concentração da droga que, em condições controladas, inibe 50% da atividade da COX.
Para a avaliação dos anti-inflamatórios não esteroidais, utiliza-se um índice de especificidade relativa entre as isoformas da COX, expresso como a razão entre os valores de IC50 para COX-1 e o IC50 para COX-2. Nesse caso, considerando a razão
de nossa estrutura de ciclopentenona dissubstituída. A molécula com substituinte 4- CH3, apesar de apresentar uma boa razão de seletividade (acima de 300), poderia apresentar uma grande instabilidade metabólica no meio biológico, uma vez que o grupo metila em posição para do anel aromático pode ser facilmente oxidada para sua forma carboxilada, antes de chegar ao alvo enzimático e, por essa razão, decidimos não a incluir na nossa nova coleção. Em contrapartida, nas posições orto e meta, o substituinte metila apresenta maior estabilidade metabólica essencialmente por questão de impedimento estérico em relação aos sítios catalíticos de enzimas metabolizadoras, tais como das enzimas do citocromo P450, um dos principais sistemas enzimáticos do organismo que atua sobre xenobióticos.
Tabela 1. Comparação dos valores de seletividade de acordo com a natureza e
padrão de substituição de anel aromático na molécula de Colecoxib, e a conveniência do emprego dos substituintes nas moléculas-alvo
X Cox-1 (IC50, µM) Cox-2 (IC50, µM) Seletividade
(*) Proposta como R2 4-CF3 > 100 8,23 12 - 4-Cl 17 0,01 1700 Ok 4-F 25 0,041 610 Ok 4-CH3 15 0,04 375 - 4-OCH3 2,58 0,008 323 Ok 4-SCH3 1,19 0,009 132 Ok 4-NHCH3 13,8 0,016 863 Ok 4-CO2H > 250 11,2 22 - 3-CH3 33,9 0,069 491 Ok
(*) expressa quantas vezes o valor de IC50 para a COX-1 é maior que o para a COX-2.
Obs: Os mais potenciais estão em destaque.
Em um segundo momento, com a colaboração do Prof. Dr. Daniel Fábio Kawano, calculamos os principais parâmetros farmacocinéticos para nossos pré- candidatos a fármacos (Tabela 2). Entre os pré-candidatos, incluímos as três moléculas que apresentam bons perfis anti-inflamatórios no trabalho de doutorado precedente (Entradas 3, 4 e 5 – Tabela 2). Além disso, como a molécula com R2 = 4- F apresentou, no estudo precedente, o perfil biológico mais promissor, incluímos também uma molécula candidata à fármaco que apresenta uma variação de posição do substituinte F na porção R2 (Entrada 2 – Tabela 2), a fim de avaliarmos o efeito dessa variação.
A hidrossolubilidade é expressa em - log [Soly], em que Soly é a solubilidade em água (mol/L) a 25 ºC. Compostos pouco solúveis apresentam valores de - log [Soly] < -4, enquanto que os muito solúveis, - log [Soly] ≥ -1. A média solubilidade, por sua vez, é indicada quando - log [Soly] é maior ou igual a -4 e menor que -1.
O volume de distribuição (VD) é um parâmetro bastante importante no planejamento de fármacos por relacionar à fração do fármaco que está distribuída pelo corpo24. Vale ressaltar que é a medida do volume aparente no qual o composto está dissolvido, e não um volume real. Dessa forma, esse parâmetro indica a proporção entre a concentração do composto no plasma e a concentração total no organismo.
A albumina é uma das proteínas plasmáticas em que os fármacos, em geral, mais se ligam. Como, normalmente, é a porção não ligada que exibe os efeitos farmacológicos, quanto menos ligante o fármaco for, mais eficiente é sua transposição em membranas celulares. A ligação à albumina é expressa em porcentagem que, como o próprio nome sugere, indica a fração do fármaco que é ligado à proteína, sendo o restante a fração que realmente é ativa e pode ser excretada pelo organismo.
Entrada R2 Hidrossolubilidade -Log [Soly] Volume de distribuição (%) Ligação à albumina (%) Estabilidade Metabólica CYP3A4 (%) Permeabilidade em Caco-2 Permeabilidade em BBB 1 Celecoxib -4,1 0,23 85 57,12 0,59 -0,07 2 3,5-F -4,32 0,15 79 45,49 0,94 0,59 3 4-F -4,35 0,09 70 44,62 0,76 0,66 4 4-SO2CH3 -4,10 -0,02 73 46,15 0,56 -0,05 5 4-SO2NH2 -4,26 0,08 64 57,93 0,06 -0,06 6 4-Cl -4,67 0,21 92 37,73 1,21 0,74 7 4-OCH3 -4,31 0,16 83 43,49 1,03 0,50 8 4-SCH3 -4,58 0,17 88 38,62 1,09 0,54 9 4-NHCH3 -4,38 0,34 86 46,64 0,88 0,10 10 2-CH3 -4,36 0,22 84 42,56 1,20 0,70 11 3-CH3 -4,46 0,19 84 40,77 1,19 0,67
A metabolização é um processo pelo qual o organismo age sobre uma substância estranha a ele (um xenobiótico) por meio de reações enzimáticas a fim de transformá-lo em substâncias mais polares e, por isso, mais fáceis de serem eliminadas. O fígado é o principal orgão de metabolização e contém a enzima citocromo P450 3A4 (CYP3A4), através da qual 40-50%25 dos fármacos são metabolizados. Se um candidato a fármaco é extensivamente metabolizado pela CYP3A4 apresentará efeito por um curto tempo e, por essa razão, a concentração terapêutica deverá ser mantida através de doses mais frequentes. A estabilidade metabólica frente à enzima CYP3A4 é expressa em porcentagem e os compostos com um percentual maior ou igual a 50% são considerados como estáveis.
O transporte de fármaco através das monocamadas de células Caco-2, uma linhagem celular de adenocarcinoma humano, está correlacionado com a biodisponibilidade e absorção in vivo26, e tem sido amplamente utilizada para rastreio de novos candidatos a fármacos. A permeabilidade em Caco-2 é expressa como valor transformado, em que um índice positivo expressa que o composto é bem absorvido e um negativo indica que o composto é fracamente absorvido.
Por fim, no sistema nervoso central encontra-se uma provável terceira isoforma da COX, a COX-3, que explica os efeitos do paracetamol.15 Como a COX-3 só foi descrita recentemente, ainda pouco se sabe sobre os efeitos de sua inibição. Dessa forma, levar em conta a permeabilidade na barreira hematoencefálica de candidatos a fármacos e, dessa forma, o acesso à essa isoforma, é relevante. Os compostos são classificados como tendo boa permeabilidade se LogBB > 0,5, com permeação moderada (0 < LogBB < 0,5), com capacidade reduzida para atravessar a BHE (0 < - 0,3 ≤ LogBB < 0) ou muito pouco penetração cerebral (LogBB < -0,3).
Para os cálculos desses parâmetros farmacocinéticos, mais uma vez utilizamos a molécula de Celecoxib como referência, a fim de facilitar a intepretação dos resultados como também de verificar a coerência entre eles (Entrada 1, ver Tabela
2). Como consta na Tabela 2, praticamente todos os valores dos parâmetros das
moléculas candidatas se apresentaram próximos aos do Celecoxib, com apenas algumas exceções. No entanto, essas poucas exceções não são relevantes, visto que as moléculas podem apresentar variações intrínsecas à complexidade do meio biológico e que, portanto, estes são apenas valores estimativos.
Nossa pretensão inicial foi de ampliar o número de moléculas com relação ao trabalho precedente. Para reavaliar o perfil anti-inflamatório, e para fins comparativos
apresentaram os melhores valores de seletividade na estimativa feita anteriormente (ver Tabela 1) utilizando Celecoxib como referência, além uma nova variação na posição R2, agora do substituinte metila (Entrada 11 – ver Tabela 2).
Figura 6. Escopo das moléculas para a síntese e avaliação biológica, segundo novo
4. Metodologia Sintética Geral
4.1. A reação de Morita-Baylis-Hillman
A reação de Morita-Baylis-Hillman (MBH) constitui-se basicamente da formação de uma ligação σ C-C, por meio de uma adição aldólica, entre uma olefina ativada I (geralmente acrilatos ou acrilonitrila) e um aldeído ou imina II. A reação é catalisada por uma base nucleofílica, representada por uma fosfina ou amina terciária (III) (DABCO) e conduz à formação de ésteres ou nitrilas β-hidróxi ou β-amino-α- metilênicas IV, denominados adutos de MBH (Esquema 2).