RT-PCR em tempo real

A expressão dos RNAm codificadores do FHF-1, 2, 3 e 4 foi investigada por RT-PCR em tempo real em células da teca, células da granulosa e corpos lúteos.

A fim de evitar que uma eventual contaminação por DNA genômico nas amostras de RNA total interferisse nos resultados, todas as amostras de RNA total foram tratadas com DNAse antes de serem submetidas ao RT-PCR em tempo real.

4.4.1. Protocolo DNAse I

Conforme as instruções do protocolo DNAse I - Amplification Grade (Invitrogen™), o RNA total destinado à reação de transcrição reversa foi transferido para microtubo estéril, onde acrescentou-se 1µL de tampão DNAse, 1µL de DNAse I (1U/mL) e água destilada tratada com DEPC e autoclavada na quantidade suficiente

para completar 10µL de solução. Essa solução permaneceu à temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, foi acrescida de 1µL de EDTA (25mM) e incubada a 65ºC por 10 minutos. Após a incubação, as amostras foram transferidas para gelo e imediatamente submetidas à reação de transcrição reversa.

4.4.2. Reação de transcrição reversa (RT)

Para a reação de transcrição reversa, utilizou-se o kit SuperScript III (Invitrogen™), cujo protocolo iniciou-se pela adição em microtubo estéril de 8µL da solução de RNA total resultante do tratamento com DNAse I, contendo 1µg de RNA total de células da teca e da granulosa. Ao RNA total, adicionou-se 1µL de oligonucleotídeo iniciador Oligo (dt) (500µg/µL) e 1µL de dNTP Mix (10µM). Esta solução foi incubada a 65ºC por 5 minutos e, em seguida, incubada em gelo por 1,5 minutos. Após a última incubação, adicionou-se à solução 2µL de tampão “First Strand” 5X, 4µL de MgCl2 (25mM), 2µL de DTT (0,1M) e 1µL de “RNAseOUT Inhibitor” (40U/mL). Na seqüência, a solução foi incubada a 42ºC por 2 minutos e acrescida de 1µL (200U) de Superscript III (transcriptase reversa). Seguiram-se então três incubações sucessivas. Primeiramente, a solução permaneceu a 42ºC por 50 min, depois, a 70ºC por 15 minutos e, finalmente, em gelo por 2 minutos. Após a incubação, as amostras foram testadas mantidas em gelo para utilização imediata na PCR ou armazenadas a - 20ºC.

4.4.3. Validação da PCR em tempo real

Inicialmente, para a amplificação de fragmentos dos genes FHF-1, 2, 3 e 4, foram delineados oligonucleotídeos iniciadores para reconhecer regiões idênticas entre as seqüências de ratos, camundongos e humanos disponíveis no banco de dados GeneBank, uma vez que seqüências bovinas não estavam disponíveis. A identidade dos

produtos da PCR para amplificação dos FHFs foi confirmada por seqüenciamento do DNA extraído de géis utilizando-se o kit QIAquick gel extraction (Qiagen®). O seqüenciamento foi realizado pelo colaborador Prof. Dr. José Fernando Garcia, no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular do Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, UNESP-Araçatuba.

Para amplificação do RNAm dos FHFs utilizou-se o equipamento ABI 7500 (Applied Biosystem®) através do sistema SYBR™ Green. As reações foram realizadas em placas de 96 poços, as quais continham 12,5 μl de Power Sybr Green Master Mix® – Applied Biosystems, 1ul de cDNA, oligonucleotídeos iniciadores bovino-específico e água completando o volume final de 25 μl. Como controle negativo das reações foi utilizado água em substituição ao cDNA. As condições cíclicas da PCR foram: 95ºC por 10 min, 40 ciclos de 95ºC por 15s (desnaturação) e 62ºC (GAPDH), 60ºC (CYC-A, H2A e todos os FHFs em CG, CG cultivadas e CT) e 59ºC (FHFs no corpo lúteo) por 1 minuto (anelamento e extensão), seguido de curva de dissociação padrão. Os dados de fluorescência foram coletados ao final de cada extensão.

As reações foram otimizadas a fim de propiciar máxima eficiência de amplificação para cada gene. Todos os genes endógenos apresentaram valores de eficiência acima de 92%. Os valores médios de eficiência para cada gene foram calculados pelo perfil de amplificação de amostras individualmente pelo programa LinRegPCR software (RAMAKERS et al., 2003). Os valores de eficiência para os FHFs em todos os tecidos analisados estão descritos na Tabela 2. Cada amostra foi analisada em duplicata e a especificidade dos produtos da PCR foi determinada pela análise da curva de melting e determinação do tamanho do amplicon em gel de agarose.

Tabela 1. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados na PCR em tempo

real para amplificação do GAPDH, CYC-A, H2A, FHF-1, FHF-2, FHF-3 e FHF-4.

Genes-alvo Seqüências (5’- 3’) Fragmentos

GAPDH F - GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA R - CCCTCCACGATGCCAAAGT 119pb CYC-A F – GCCATGGAGCGCTTTGG R - CCACAGTCAGCAATGGTGATCT 65pb H2A F – GAGGAGCTGAACAAGCTGTTG R - TTGTGGTGGCTCTCAGTCTTC 74pb FHF-1 F- CCAGCAGGGATATTTCCTGC R - GGCCCACAGGGATTAGATTGA 123pb FHF-2 F – AGCTCACTTTCTGCCCAAACCA R - ATAGACTTGCCTCCGTTCAGCA 144pb FHF-3 F – TCTACCTCCAGGCGAATCCC R - GACTACTCGCAGCCCCACAG 101pb FHF-4 F – ACCCCGATGGAGCTCTCG R - ACTCCCTGGATTGCAACGAC 100pb

(F = “foward”; R = “reverse”; pb = pares de bases)

Tabela 2. Valores de eficiência de amplificação dos genes-alvo nos tecidos analisados. Genes-alvo Tecidos Granulosa Granulosa cultivada-FSH Granulosa

cultivada-IGF1 Teca Corpo Lúteo

FHF-1 _{79% 80% 89% 70% 89%}

FHF-2 _{77% 89% 79% 78% 97%}

FHF-3 _{91% 88% 79% 76% 96%}

FHF-4 _{90% 90% 79% 89% 99%}

Os genes GAPDH, Ciclofilina (CYC-A) e Histona (H2A) foram testados através do programa geNorm (Microsoft®) para seleção do controle endógeno mais estável para cada tipo celular analisado. A CYC-A foi o melhor controle endógeno para CT e CL. Para CG e CG cultivadas, foram escolhidos GAPDH e H2A, respectivamente.

A expressão relativa de cada gene alvo foi calculada utilizando o método ΔΔCt e foi corrigida pela eficiência de amplificação das reações utilizando-se a equação descrita por Pfaffl (PFAFFL, 2001; Figura 4). Para cada primer, a linha de “threshold” foi fixada no ponto médio da janela de linearidade, determinada pelos valores mínimos e máximos de fluorescência. Uma amostra foi escolhida aleatóriamente para cada gene em cada tipo celular analisado e foi utilizada como controle.

Figura 4. Modelo matemático da expressão relativa por PCR em tempo real. A razão de

um gene alvo é expressa em uma amostra em relação à amostra controle e à expressão do gene endógeno. Etarget é a eficiência do transcrito do gene alvo; Eref é a eficiência do transcrito do gene referência; ΔCPtarget é desvio de CP do controle – amostra do gene alvo transcrito; ΔCPref é desvio de CP do controle – amostra do gene referência transcrito.