RT-PCR, PCR quantitativa e tempo de meia-vida

Para a avaliação do tempo de meia-vida dos alvos escolhidos para estudo, o processo de transcrição dos parasitas foi interrompido e a quantidade de cada alvo foi avaliada em intervalos de tempo pré-definidos. A interrupção da transcrição foi feita como descrito por CLAYTON e colaboradores (2007), com a adição de sinefungina (interrompendo trans-splicing) e actinomicina D (interrompendo transcrição). Em cada etapa desse experimento grânulos de TcDHH1 foram monitorados por IFI.

3.10.1 Inibição da transcrição

Parasitas em estágios distintos de diferenciação foram contados e diluídos para uma concentração de 2,5 x 10⁷ células/ml de meio. Os experimentos foram feitos em duplicata experimental. Adicionou-se sinefungina (Sigma) a uma concentração final de 2,5 μg/ml e a cultura foi incubada a 28ºC por 5 minutos. Antes de adicionar a actinomicina D (Sigma), uma alíquota de 2 ml foi retirada (t0) e centrifugada a 7000 x g por 2 minutos, o sobrenadante foi desprezado. Após a adição de actinomicina D a uma concentração final de 10 μg/ml, alíquotas de 2 ml foram retiradas em tempos de 10 (t1), 20 (t2), 30 (t3) minutos e 1 hora (t4), foram centrifugadas como descrito acima e o sobrenadante foi desprezado. A partir dos sedimentos dos parasitas tratados, prosseguiu-se para a extração de RNA com auxílio do kit RNeasy (QIAGEN), de acordo com o item 3.4.6. Os RNAs foram dosados por meio do equipamento NanoDrop™ 1000 (Thermo Scientific) e estocados a -20ºC para posterior uso.

3.10.2 Transcrição Reversa

A reação de transcrição reversa é feita com o auxílio do kit Improm II™ (Promega) segundo o manual do fabricante. Cerca de 1 μg de RNA purificado em um volume total de 8,6 μl foi misturado com 1 μl de oligo-dT 10 μM e incubado sequencialmente a: 70 ºC por 10 minutos, 4 ºC por 5 minutos, 25 ºC por 5 minutos e 4 ºC por 10 minutos.

Posteriormente, foram adicionados: 4 μl de tampão 5X, 1 μl de dNTPs 10 mM, 2,4 μl de MgCl2 25 mM, 40 unidades de RNase OUT® e 1 μl da enzima transcriptase reversa e as amostras foram incubadas a 42 ºC por duas horas. Após esta etapa, o cDNA pode ser purificado por meio do filtro Microcon® (Millipore), como descrito no manual do fabricante.

As amostras de cDNA purificado foram armazenadas a -20ºC até o momento do uso.

3.10.3 PCR Quantitativa (PCR em Tempo Real)

PCR em tempo real é um método capaz de quantificar o cDNA presente na amostra original. Isso significa que, ao amplificarmos um inserto, ou um cDNA (que provém de uma população de mRNAs com taxas diferentes de transcrição) é possível quantificarmos a abundância de cada RNA presente na amostra extraída e compará-la com outros estágios do ciclo de vida. Além disso, podemos comparar esse RNA com outros RNAs que possuem diferentes taxas de transcrição. Isso ocorre uma vez que a detecção da quantidade de DNA amplificado é medida ciclo a ciclo, em tempo real, por meio da medição de fluorescência (de um reagente específico adicionado) que aumenta de acordo com o número de moléculas amplificadas.

Antes da utilização dos pares de oligonucleotídeos iniciadores para cada alvo escolhido nos testes de tempo de meia vida, foi necessário padronizar as condições para cada PCR. Dessa forma, foram testados os mesmos oligonucleotídeos já mencionados no Quadro 05 e ainda foram confeccionados outros pares de nucleotídeos para cada alvo selecionado, específicos para a PCR quantitativa e podem ser visualizados no Quadro 08.

Gene ID Iniciador Sequência Amplicon (bp) TcAMA Tc00.1047053506437.10 F2 5’ CGTTGTGGGGAATTAAGGAGGACTG 3’

R2 5’ CCTCAAGACTGAGGGGCAAGCA 3’ 89

TcCYC Tc00.1047053506945.270 F2 5’ CGAACCGGGCTGAGATCGCC 3’

R2 5’ CAAACTCGGCCCCTGGTGCA 3’ 118

TcHYP Tc00.1047053509891.40 F2 5’ GCTGGGAATTGGCGGCAGGT 3’

R2 5’ TTTGCATGACGGCATCCGAAAAAGT 3’ 135

TcRBP5 Tc00.1047053511481.70 F2 5’ TGCAGCGTCAAGGAAGGAAGGG 3’

R2 5’AGTCCAGGGGAAGGCTGGCA 3’ 186

TcMASP Tc00.1047053504239.110 F2 5’ AGCTACCTGATGTCGGCCCA 3’

R2 5’ TCCATCAGGCACCGTATGATCGACA 3’ 86

TcMUC Tc00.1047053506131.20 F2 5’ TTCATCACCTTCTCAGCCACCGGA 3’

R2 5’ TTGGGTTCCCGGTAACGTGACAG 3’ 103

TcCTL1 Tc00.1047053506585.40 F2 5’ CTCCGGACGGCACCGGGAAG 3’

R2 5’ TCGCACCGTCGCCAATGAGAC 3’ 183

TcCTL2 Tc00.1047053510993.10 F2 5’ACAACGTGCAAAGGCTTCTT 3’

R2 5’ CTCGTGCCAACTCCAAGTTT 3’ 210

Quadro 08. Iniciadores utilizados para PCR quantitativa dos alvos de TcDHH1.

A reação foi feita a partir de 1 ng de cDNA, 4 pmol de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores, 10μl de SYBR^® Green (Applied Biosystems) em um volume total de 20 μL. O programa utilizado conteve desnaturação inicial de 10 minutos a 95 °C, seguida de 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 60 °C por 30 segundos e 72 °C por 1 minuto, com um passo final de dissociação. A leitura da emissão fluorescente foi realizada a cada etapa de extensão. Uma diluição seriada de 4 concentrações conhecidas de cDNA, com razão de 1:5 para cada ponto serviu como curva padrão. Para a comparação dos dados com genes abundantes foram utilizados iniciadores para amplificação dos genes da proteína TcL9 da subunidade ribossomal 60S (Tc00.1047053506835.30), da proteína Tcα-tubulina (Tc00.1047053411235.9) e da proteína Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TcGAPDH, Tc00.1047053510105.230) que podem ser visualizados no Quadro 09.

Gene ID Iniciador Sequência Amplicon (bp)

TcL9 Tc00.1047053506835.30

F1 5’ CGAACCTTCACTGCCGTTCGTTG 3’

R1 5’ GCCGGCGAACACGCTTCTCG 3’ 214

F2 5’ CCTTCACTGCCGTTCGTTGGTTTG 3’

R2 5’ ATGCGAGAGTGCCGTGTTGATGGT 3’ 68

Tcα-Tubulina Tc00.1047053411235.9

F1 5’ GGTGTTTGAGCCGGCGTCGA 3’

R1 5’ CACCACCGTAGGGGGCTGGT 3’ 208

F2 5’ TCGGCGGAGAAGGCATACCAC 3’

R2 5’ TCATCATCGACGCCGGCTCAAACA 3’ 79

TcGAPDH Tc00.1047053510105.230

F1 5’ CTCACCGCGCGTCTGGAGAG 3’

R1 5’ ACGAGATGAGCTTCACGAGGCGA 3’ 205

F2 5’ AGGTCGGCGCGGTGGTCGTGGTC 3’

R2 5’ TCTTTGCGCCGGCCTGAATGTGCT 3’ 87

Quadro 09. Iniciadores utilizados para normalização da PCR quantitativa.

3.10.4 Análise dos Dados

Em uma PCR quantitativa, é ideal que a eficiência da PCR seja de 100%, ou seja, que a cada ciclo, o produto de PCR deva dobrar em quantidade. Essa eficiência é calculada através do coeficiente angular da curva padrão e para uma eficiência de 100%, o coeficiente angular ideal é de -3,32. Reações de PCR com eficiência entre 90 e 110%

são ótimas, portanto, o coeficiente angular deve variar de -3,58 a -3,10, com algumas exceções.

Além disso, para avaliar o desempenho de um par de oligonucleotídeos iniciadores, as diluições em série da curva padrão devem retornar amplificações que se aproximem à reta da curva padrão. Portanto, esse parâmetro pode ser avaliado pelo coeficiente de correlação (R²), que estima o quanto cada ponto se afasta da reta proposta. O coeficiente de correlação deve ser maior do que 0,99 para que a reta seja confiável.

Cada curva padrão foi construída em triplicatas técnicas e biológicas e a partir disso, foi possível calcular as quantidades de produto de PCR em cada ponto de parada de transcrição (T0, T1, T2, T3 e T4, como descrito no item 3.10.1, Material e Métodos) e construir a curva de decaimento para cada alvo.

Uma vez que o decaimento de mRNA pode ser considerado uma reação cinética de primeira ordem (onde apenas a quantidade inicial de material afeta a equação),

quando plotamos um gráfico de decaimento semilogarítmico (Ln da quantidade restante de material em cada tempo) versus tempo (em minutos), podemos utilizar o coeficiente angular da reta resultante como sendo menos a constante de equilíbrio de decaimento(-k) (MAQUAT & KILEDJIAN, 2008).

A partir disso, seguindo a equação geral de tempo de meia-vida (t1/2) para reações de primeira ordem, temos que:

𝑡1

2 = 𝑙𝑛2 𝑘

onde, k é a constante de equilíbrio de decaimento e o tempo de meia-vida é calculado em minutos. A partir de todas essas informações acima, foi possível calcular o tempo de meia-vida para cada alvo escolhido.