Síntese das nanopartículas de ouro

As nanopartículas de ouro (NpAu) foram sintetizadas pelo método de Turkeivich, que consiste na redução de ouro (III), na forma de HAuCl4 0,01%, pela reação com citrato de sódio e

ácido ascórbico, sob agitação a 90 ºC.126 A solução resultante de NpAu (1,17×10-10 mol L-1) exibiu coloração violeta, característica do diâmetro hidrodinâmico (37 nm) das nanopartículas.

4.4 Instrumentação

Os experimentos eletroquímicos foram realizados em sistema composto por três eletrodos, conectados a potenciostato modelo PGSTAT 30 (Autolab, Eco Chemie) e controlados por computador, usando o programa GPES versão 4.9. Os biossensores enzimáticos foram utilizados como superfície de trabalho, um tarugo de carbono vítreo como eletrodo auxiliar e Ag/AgCl/Cl-sat

em meio de KCl como eletrodo de referência. Para o processo de esfoliação do grafeno em N- metil-2-pirrolidona assistido por sonicação, utilizou-se sonicador com ponta de titânio (Bandelin Sonoplus). A caracterização do grafeno foi realizada por TEM (do inglês Transmission Electron

Microscopy), com uso de microscópio modelo H-9000NA (Hitachi), operando a 200-300 kV. A

composição química da superfície foi obtida por XPS (do inglês X-ray Photoelectron

Spectroscopy), utilizando espectrofotômetro modelo ESCALAB 200A (VG Scientific), com

radiação de 1486,6 eV. O tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta das nanopartículas de ouro foram caracterizados por espalhamento dinâmico da luz e por velocimetria de radiação a laser pelo efeito Doppler, respectivamente, com Zetasizer Nano ZS a 25 ºC. Para os ajustes de pH empregou-se pHmetro modelo B474 e AJX-511 (Micronal). Tubos QuEChERS, adquiridos da

United Chemical Technologies, Inc., foram utilizados para extração de resíduos de pesticidas nos

alimentos naturais. As amostras foram pesadas em balança analítica NewClassic MS (Mettler Toledo). Os extratos, preparados em acetonitrila, foram agitados em vortex VM-96E (Shimadzu) e decantados em centrífuga de alta rotação Himac CT15E/CT15RE (Shimadzu). O analito dissolvido no solvente orgânico foi levado à secura em rotaevaporador R-250 EX (Büchi). O sistema de vácuo utilizado nos processos de filtração forçada e de rotaevaporação consistiu em Vacuum Manifold (Supelco). A água usada para preparação das soluções foi purificada em sistema Milli-Q (Millipore, Inc.), com resistividade de 18,2 M cm.

4.5 Biossensores enzimáticos

CBM sofrem processo de oxidação em potenciais positivos elevados e são susceptíveis a interferências.127,128 Nesse caso, o uso dos biossensores enzimáticos é mais adequado, em virtude de maior seletividade e de menor nível de interferentes (≈ 0,0 V vs. Ag/AgCl/Cl-sat).127,128 O

Químicas (GRAQ) do Instituto Superior de Engenharia do Porto, associado ao Laboratório de Química Verde – REQUIMTE da Universidade do Porto, em Porto-Portugal. Estudos paralelos feitos com eletrodos compósitos de carbono mostraram que estes materiais conferem maior aderência dos agentes modificadores e estabilidade dos biodispositivos, em comparação a outras superfícies eletródicas mais utilizadas, tais como eletrodos de carbono impressos, carbono vítreo e ouro, justificando sua escolha como transdutor para a construção dos biossensores. Nesse trabalho foram contemplados três biossensores enzimáticos: (i) eletrodo de pasta de MWCNT modificado por LAC(s) entrapped (aprisionada) no material compósito, definido como LAC-

EPNC; (ii) eletrodo de pasta de grafeno (EPG) modificado eletroquimicamente com filmes de Azul da Prússia (AP), seguido da imobilização de LAC por drop coating (gotejamento), sendo definido como LAC/AP/EPG e, por último, (iii) biossensor bi-enzimático, desenvolvido pela eletrodeposição de filmes híbridos sobre EPG. Os filmes foram constituídos de matriz polimérica de quitosana (CS) e NpAu, posteriormente enriquecida com as enzimas LAC e TIR, definido como LAC-TIR-NpAu-CS/EPG.

4.5.1 Desenvolvimento do biossensor enzimático LAC-EPNC

Inicialmente, foi preparada a pasta de carbono contendo MWCNT, pó de grafite e óleo de parafina em diferentes proporções (0:60:40, 30:30:40 e 60:0:40%, m/m/m), a fim de confrontar a eficiência dos nanotubos na composição do dispositivo. O compósito resultante foi modificado com a enzima LAC (0,5 U mg-1) extraída do fungo Trametes versicolor, utilizada como elemento de biorreconhecimento do dispositivo. Para isso, duas estratégias de imobilização foram estudadas: drop coating da solução enzimática (10 U mL-1), com concentração previamente otimizada por estudos preliminares, utilizando 4-AMF como substrato em tampão BR pH 5,0; e

entrapment de diferentes proporções de LAC(s) (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10%, m/m) no

próprio material compósito, baseando-se na intensidade do processo redox, tempo de incubação e estabilidade do sinal analítico, obtido após a catálise enzimática. Posteriormente, o compósito resultante, com ou sem a modificação da enzima, foi embutido em tubo de Teflon® (1,0 mm de diâmetro interno) e o contato elétrico foi realizado com pistão de aço inoxidável. A renovação da superfície do dispositivo foi realizada por pressão cuidadosa do pistão sobre folhas de papel com baixa rugosidade, seguido da limpeza com água destilada antes de cada medida.

4.5.2 Desenvolvimento do biossensor enzimático LAC/AP/EPG

Inicialmente, foi preparada pasta de grafite convencional, contendo pó de grafite de grau espectroscópico e parafina (70:30%, m/m).129 Em seguida, diferentes proporções de grafeno (10, 15, 20, 25 e 30%, m/m) foram adicionadas. A mistura resultante foi embutida em tubo de Teflon® (1,0 mm de diâmetro interno) e o contato elétrico foi realizado com pistão de aço inoxidável. Os filmes de AP foram formados pela imersão do EPG na solução A (FeCl3 2,0×10-3 mol L-1,

K3[Fe(CN)6] 2,0×10-3mol L-1, KCl 0,1 mol L-1 e HCl 0,1 mol L-1), onde 0,4 V foi aplicado em

diferentes intervalos de tempo (5, 10, 15, 20, 30 e 40 s). Após o processo de eletrodeposição, a superfície do eletrodo foi lavada com água ultrapura para remover o excesso de eletrodepósito e, em seguida, ativada na solução B (KCl 0,1 mol L-1 e HCl 0,1 mol L-1) com vinte ciclos entre 0,05 e 0,35 V a 40 mV s-1.130 A imobilização de LAC (0,5 U mg-1) extraída do fungo Trametes

versicolor foi realizada por drop coating da solução enzimática (5,00; 7,50; 10,0; 12,5 e 15,0 U

mL-1) sobre o filme de AP. A intensidade do processo redox, tempo de incubação e estabilidade do processo de oxidação do 4-AMF em tampão BR pH 5,0, obtido após a catálise enzimática, foram utilizados como critérios para a otimização da concentração de LAC no dispositivo.

4.5.3 Desenvolvimento do biossensor bi-enzimático LAC-TIR-NpAu-CS/EPG

Solução de CS (250-300 kDa, Altakitin) 1,0 % m/v foi preparada pela dissolução de 0,1 g em 10 mL de ácido acético 0,05 mol L-1.130 Em seguida, diferentes proporções de NpAu (10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70%, v/v) foram misturadas à matriz de CS, até a formação de material compósito uniforme.130 Finalmente, essa mistura foi enriquecida com LAC(s) de Trametes

versicolor (0,5 U mg-1) e TIR(s) de Agaricus bisporus (1,0 U mg-1) em várias proporções (4:1,

3:1, 2:1, 1:1, 1:0, 0:1, 1:2, 1:3, 1:4%, m/m), resultando em material híbrido e eficiente para catalisar a oxidação de derivados fenólicos.131 A proporção enzimática no compósito foi definida com base no processo de oxidação do substrato 4-AMF em meio de tampão BR pH 5,5, levando em consideração a intensidade do processo redox, tempo de incubação e estabilidade do sinal analítico, obtido após a catálise enzimática. Considerando que CS é um veículo adequado para carrear NpAu e a mistura das polifenoloxidases, filme híbrido fino do material compósito foi

eletrodepositado sobre EPG, previamente embutido em tubo de Teflon® (1,0 mm de diâmetro interno) e em contato com pistão de aço inoxidável, aplicando potencial de -1,5 V por 200 s.130