SÍNTESE DE DNA COMPLEMENTAR - 3 CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1 CASUÍSTICA

3 CASUÍSTICA E MÉTODOS 3.1 CASUÍSTICA

3.5 SÍNTESE DE DNA COMPLEMENTAR

A quantificação do RNA foi realizada por fluorimetria utilizando- se o Qubit™ Quantitation Platform (Invitrogen) e a sua qualidade foi avaliada pela visualização das bandas de RNA ribossomal (RNAr) em eletroforese em gel de agarose 2%. Foram consideradas amostras de boa qualidade aquelas que não apresentavam rastro abaixo das bandas de RNAr e cuja a banda referente ao RNAr 28S apresentava o dobro da intensidade da banda do rRNA 18S.

Para a síntese do cDNA, de 1 μg a 5 μg de RNA total foram adicionados em microtubos de 0,2 mL. O possível DNA contaminante nas amostras foi eliminado por digestão com DNase. Para tanto, adicionou-se ao RNA total 1 µL de DNase (1 U/µL), 1 µL de tampão de reação e água tratada com dietil pirocarbonato (água-DEPC) até o volume para 10 μL. Após digestão de 15 minutos a temperatura ambiente, a DNase foi inativada por 1 µL de EDTA (25 mM) e incubação de 10 minutos a 65 °C.

Após a inativação da DNase, as amostras foram submetidas a uma incubação de 5 minutos a 70 ºC, seguida de uma incubação em gelo por 5 minutos. Após a incubação em gelo, a cada tubo de amostra foram adicionados 15 µL de solução mix contendo: 5 μL de tampão 5x first

strand (250 mM Tris-HCl, pH 8,3; 375 mM KCl; 15 mM MgCl2), 2 μL de DTT (0,1M), 2 μL de random hexamers (100 ng/μL), 0,4 μL de dNTP mix (100 mM cada), 0,5 μL de RNAse (40 U/μL), 0,5 μL de transcriptase reversa (200 U/μL) e água-DPEC q.s.p. para 15 μL. As amostras foram então levadas ao termociclador (Mastercycler Personal, Eppendorf) e submetidas à seguinte programação: 25 ºC por 5 minutos, 37 ºC por 60 minutos e 90 ºC por 5 minutos. Ao fim da programação, as amostras foram incubadas em gelo por 5 minutos. As amostras de cDNAs foram dosados por fluorimetria utilizando-se o Qubit™

Quantitation Platform (Invitrogen) e armazenados em freezer a menos

20 ºC para serem posteriormente utilizados nos ensaios de detecção da transcrição dos genes de resistência e na pesquisa da presença de translocações cromossômicas.

3.6 DETECÇÃO DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA DE abcb1, abcc1, lrp E survivina POR TRANSCRIÇÃO REVERSA - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE SEMIQUANTITATIVA (RT-PCR SEMIQUANTITATIVA)

A avaliação de transcrição gênica das proteínas de resistência foi realizada utilizando-se a técnica de RT-PCR semiquantitativa.

Os pares de oligonucleotídeos iniciadores ou primers (Quadro 5) utilizados para avaliar a transcrição de abcb1, abcc1, lrp e survivina foram previamente descritos por Valera et al. (2004) e por Liu et al. (2005) e a transcrição de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapdh) foi utilizada para a normalização das bandas.

Quadro 5 – Sequência dos primers para a detecção de abcb1, abcc1, lrp e survivina.

pb – Pares de base. Adaptado de: VALERA et al., 2004; LIU et al., 2005.

Todas as reações foram preparadas com um volume final de 50 μL. As reações de PCR com os primers para abcb1 e lrp, foram realizadas nas seguintes condições: 1 μg de cDNA, 5 μL de tampão 10X concentrado para Taq DNA polimerase (20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 50 mM KCl), 0,75 μL de MgCl2 (50 mM), 0,4 μL de dNTP mix (100 mM de cada), 1 μL de primer sense e antisense (10 µM cada), 0,4 μL de Taq DNA polimerase (5 U/μL) e água ultra-pura q.s.p para 50μL. As condições das reações com os primers para abcc1, survivina e gapdh foram iguais as dos outros primers com exceção da quantidade de MgCl2, que foi de 1,5 µL (50 mM).

As amostras foram inicialmente desnaturadas a 94 °C por 5 minutos e, depois, submetidas às condições de reação ideal para cada

Gene Sequência Tamanho

do produto abcb1 sense 5’–CCCATCATTGCAATAGCAGG–3’ 157 pb

antisense 5’–GTTCAAACTTCTGCTCCTGAG–3’

abcc1 sense 5’–TGGGACTGGAATGTCACG–3’ 260 pb antisense 5’–AGGAATATGCCCCGACTTC–3’

lrp sense 5’–GTCTTCGGGCCTGAGCTGGTGTCG–3’ 240 pb antisense 5’–CTTGGCCGTCTCTTGGGGGTCCTT–3’

survivina sense 5’–CTTTCTCAAGGACCACCGCATC–3’

393 pb antisense 5’–CAATCCATGGCAGCCAGCTGC–3’

gapdh sense 5’–CGTCTTCACCACCATGGAGAA–3’ 330 pb antisense 5’–GAGGCAGGGATGATGTTCTG–3’

par de primers, conforme Quadro 6. Ao fim dos ciclos da PCR, foi realizada uma extensão final 72 °C por 10 minutos. As condições ideais de reação e o número de ciclos utilizados foram estabelecidos em ensaios prévios realizados no Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias (LOEH) de forma que a PCR terminasse na fase exponencial da amplificação.

Quadro 6 – Condições de reação para a detecção de abcb1, abcc1, lrp e survivina.

Os produtos das PCRs foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% a 100 volts por 30 minutos e corados com brometo de etídio. As bandas foram visualizadas em transiluminador (HOEFER- MacroVue UV-20) sob luz UV de 320 nm (Figura 10) e fotografadas com o sistema de foto-documentação de géis (DOC-PRINT®, Biosystems). O tamanho dos fragmentos foi estimado, por comparação, com o marcador de tamanho molecular 50 pb.

Primer Desnaturação Pareamento Extensão Ciclos

abcb1 94°C/1 min. 53°C/1 min. 72°C/1 min. 25 abcc1 94°C/1 min. 60°C/1 min. 72°C/1 min. 30

lrp 94°C/1 min. 64°C/1 min. 72°C/1 min. 30

survivina 94°C/1 min. 61°C/1 min. 72°C/1 min. 40 gapdh 94°C/30 seg. 60°C/30 seg. 72°C/30 seg. 25

Figura 10 – Gel de agarose 2% representativo dos controles positivos da reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção de abcb1 (K562-LUCENA), abcc1(Jurkat), lrp (Jurkat) e survivina (K562).

Linha 1 – Marcador de tamanho molecular 50 pb; Linha 2 – Produto da PCR com os primers para gapdh (330 pb); Linha 3 – Produto da PCR com os primers para abcb1 (157 pb); Linha 4 – Produto da PCR com os primers para abcc1 (260 pb); Linha 5 – Produto da PCR com os primers para lrp (240 pb); Linha 6 – Produto da PCR com os primers para survivina (393 pb); Linha 7 – Controle negativo com água.

A intensidade média de cada banda foi avaliada pelo programa de análise digital (NIH ImageJ1.40 software, National Institute of

Health website). A intensidade das bandas dos genes abcb1, abcc1, lrp

e survivina foi dividida pela intensidade do gene normalizador gapdh. Os resultados foram relatados na forma de transcrição relativa.

3.7 PESQUISA DAS TRANSLOCAÇÕES t(8;21)(q22;q22), t(9;22)(q34;q11), t(15;17)(q22;q21) E inv(16)(p13;q22)

A pesquisa das translocações cromossômicas foi realizada utilizando-se a técnica de RT-PCR seguida por uma nested PCR.

Linha 1 2 3 4 5 6 7

300pb 150pb

Os primers (Quadro 7) e as condições da PCR utilizadas para a pesquisa das translocações cromossômicas foram as descritas pelo programa BIOMED-1 (VAN DONGEN et al., 1999).

Quadro 7 – Sequência dos primers para a pesquisa das translocações cromossômicas.

Adaptado de: VAN DONGEN et al., 1999.

Translocação Primer Sequência

t(8;21)(q22;q22) AML1-A 5’–CTACCGCAGCCATGAAGAACC–3’ ETO-B 5’–AGAGGAAGGCCCATTGCTGAA–3’ AML1-C 5’–ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG–3’ ETO-D 5’–TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT–3’ AML1-E5’ 5’–TGGCTGGCAATGATGAAAACTACT–3’ t(9;22)(q34;q11) p190 BCR-e1-A 5’–GACTGCAGCTCCAATGAGAAC–3’ ABL-a3-B 5’–GTTTGGGCTTCACACCATTCC–3’ BCR-e1-C 5’–CAGAACTCGCAACAGTCCTTC–3’ ABL-a3-D 5’–TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA–3’ ABL-a3-E3’ 5’–TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT–3’ t(9;22)(q34;q11) p210 BCR-b1-A 5’–GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTCC–3’ ABL-a3-B 5’–GTTTGGGCTTCACACCATTCC–3’ BCR-b2-C 5’–CAGATGCTGACCAACTCGTGT–3’ ABL-a3-D 5’–TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA–3’ ABL-a3-E3’ 5’–TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT–3’ t(15;17)(q22;q21) PML-A1 5’–CAGTGTACGCCTTCTCCATCA–3’ PML-A2 5’–CTGCTGGAGGCTGTGGAC–3’ RARA-B 5’–GCTTGTAGATGCGGGGTAGA–3’ PML-C1 5’–TCAAGATGGAGTCTGAGGAGG–3’ PML-C2 5’– AGCGCGACTACGAGGAGAT–3’ RARA-D 5’–CTGCTGCTCTGGGTCTCAAT–3’ RARA-E3’ 5’–GCCCACTTCAAAGCACTTCT–3’ inv(16)(p13;q22) CBFB-A 5’–GCAGGCAAGGTATATTTGAAGG–3’ MYH11-B1 5’–TGAAGCAACTCCTGGGTGTC–3’ MYH11-B2 5’–TCCTCTTCTCCTCATTCTGCTC–3’ CBFB-C 5’–GGGCTGTCTGGAGTTTGATG–3’ MYH11-D1 5’–TCCCTGTGACGCTCTCAACT–3’ MYH11-D2 5’–CTTGAGCGCCTGCATGTT–3’ CBFB-E5’ 5’–CAGGGAGAACAGCGACAAACA–3’

Para as primeiras PCRs de todas as translocações cromossômicas, foram utilizados os primers codificados como A (sense) e B (antisense). Para evitar a liberação de resultados falso positivos, paralelamente à primeira PCR, foi realizada uma PCR confirmatória com os primers C (sense) e E3’ (antisense), com exceção da t(8;21)(q22;q22) e da inv(16)(p13;q22) em que os primers confirmatórios utilizados foram os codificados como E5’ (sense) e D (antisense). As nested PCRs foram realizadas utilizando-se os primers codificados com C (sense) e D (antisense).

As reações foram preparadas com um volume final de 50 μL. A solução mãe da PCR foi preparada da seguinte forma: 2 μL de cDNA, 5 μL de tampão 10X concentrado para Taq DNA polimerase (20 mM Tris- HCl, pH 8.4; 50 mM KCl), 1,5 μL de MgCl2 (50 Mm), 0,4 μL de dNTP mix (100 mM de cada), 1 μL de primer sense e antisense (10 µM cada),

0,4 μL de Taq DNA polimerase (5 U/μL) e água ultra-pura q.s.p para 50 μL. As reações de nested PCR foram realizadas sob as mesmas condições, exceto que, ao invés de DNA genômico, foi utilizado como molde 1 µL do produto de amplificação dos primers A e B da primeira PCR.

As condições de reação foram: desnaturação inicial a 95 ºC por 30 segundos, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95 ºC por 30 segundos, pareamento a 65 °C por 1 minuto e extensão a 72 ºC por 1 minuto. O produto das PCRs foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 2% a 100 volts por 30 minutos e corado com brometo de etídio. As bandas foram visualizadas em transiluminador sob luz UV de 320 nm. O tamanho dos fragmentos foi estimado, por comparação, com o marcador de tamanho molecular 50 pb (Quadro 8).

Quadro 8 – Tamanho esperado dos produtos de PCR para a pesquisa das translocações cromossômicas, segundo o par de primers utilizado.

pb – Pares de base; NA – não aplicável. *O tamanho do produto é variável devido a variabilidade dos pontos de quebra do éxon 6 no gene PML. Adaptado de: VAN DONGEN et al., 1999.

t(8;21)(q22;q22)