Segunda etapa – Cultivo de microrganismos

A segunda etapa teve como objetivo avaliar a remoção de hormônios pelo processo de biodegradação, por meio da obtenção de um consórcio bacteriano capaz de consumir os hormônios.

Para tanto, um reator aeróbio foi utilizado para realizar o enriquecimento do lodo ativado. O reator foi operado por 105 dias, sendo que, ao longo dos primeiros 70 dias foram monitoradas a concentração dos hormônios na saída do reator, e a diversidade da comunidade bacteriana presente no interior do reator.

A partir do consórcio bacteriano obtido no reator, foi realizada uma seleção de microrganismos através de técnicas de cultivo. A capacidade de degradação dos hormônios, pelo grupo de microrganismos selecionados, foi avaliada através de ensaios cinéticos. 3.2.2.1 Cultivo de microrganismos em reator de enriquecimento

O enriquecimento foi realizado em um reator piloto abastecido uma única vez com o lodo ativado proveniente da ETE1. A inicialização do reator foi realizada com 2300 mL de lodo ativado e 2000 mL de meio sintético, volume útil de 4,3 litros, sendo que a concentração inicial de SSV no sistema foi de 2000 mg/L. A alimentação com meio sintético, contendo nutrientes (Tabela 3.1), e solução dos três hormônios, em

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concentrações conhecidas, dissolvidos em água ultrapura, foi realizada diariamente conforme Tabela 3.4, com o objetivo de favorecer o crescimento/replicação de bactérias capazes de consumir hormônios. A concentração inicial de hormônios foi estabelecida com base no estudo realizado por Yu, Roh e Chu (2007).

Observa-se na Tabela 3.4 que após 16 dias de operação as condições operacionais foram alteradas. Estas alterações foram necessárias devido a grande perda de biomassa ocorrida nos primeiros dias, portanto o volume de alimentação foi reduzido. A composição e a concentração foram alteradas devido à observação de um rápido consumo dos hormônios naturais e ao acúmulo do hormônio sintético. Este acúmulo também foi responsável pela retirada deste composto, da solução de abastecimento, a partir do dia 47.

O reator foi provido de um sistema de fornecimento de oxigênio (bombas e difusores de ar), para garantir as condições aeróbias necessárias, e foi mantido na ausência de luz a 25 ⁰C. O reator foi operado na forma de batelada sequencial, sendo que cada ciclo de 24 h é composto pelas etapas apresentadas na representação esquemática da Figura 3.2, estes ciclos foram mantidos durante os primeiros 70 dias de forma ininterrupta. Este tempo foi estabelecido com base nos estudos realizados por Yoshimoto et al. (2004). No dia 71, a realização dos ciclos, compostos por etapas diárias de alimentação e descarte, foi cessada e o reator foi mantido em funcionamento por mais 34 dias sob as mesmas condições anteriores, conforme Tabela 3.4.

Tabela 3.4 – Condições de operação do reator de enriquecimento.

Dia de operação Volume (mL/d) de alimentação e descarte Composição da solução de abastecimento (%) Concentração de hormônios (mg/L)

Meio Hormônios E1 E2 EE2

01-16 950 75 25 2,5 2,5 2,5

17-46 450 50 50 3,5 3,5 1,5

47-70 450 50 50 3,5 3,5 0,0

71 Interrupção das etapas de alimentação e descarte. 71-105 Permanência sob aeração a 25 ⁰C, na ausência de luz.

Figura 3.2 – Representação esquemática das etapas de operação do reator de enriquecimento. Alimentação (1 min) Sedimentação (15 min) Retirada (1 min) 4,3 L Meio sintético + Lodo Reservatório de alimentação E1, E2, EE2 Aeração (23 h 43 min)

Ao longo do período em que ocorreram as etapas de alimentação e descarte, foram coletadas 30 amostras efluentes para determinar a concentração dos hormônios e avaliar o comportamento de degradação destes compostos. Também foram coletadas 10 amostras da biomassa do reator, em períodos espaçados, para caracterizar a diversidade da comunidade bacteriana, ou seja, diversidade de microrganismos, através da técnica de PCR-DGGE. Uma amostra efluente e uma amostra da biomassa também foram obtidas no dia 105 com o mesmo intuito. 3.2.2.2 Seleção de grupos de microrganismos

Para selecionar grupos de microrganismos foram adotados os procedimentos apresentados na Figura 3.3. Inicialmente duas quantidades diferentes da biomassa presente no reator da seção 3.2.2.1 (2,5 e 10 mL, diluídos em água para um volume final de 10 mL) foram adicionadas a erlenmeyers de 250 mL contendo 45 mL de meio sintético (Tabela 3.1) e 45 mL de solução de hormônios (3,5 mg/L de E1 e E2 e 1,0 mg/L de EE2).

Este conjunto ficou sob agitação a 25 ⁰C por 48 h. Após este período, uma solução foi preparada para cada amostra, na diluição de 1000 vezes. Um volume igual a 50 µL de cada uma das soluções foi adicionado a placas de Petri contendo 50% de meio sintético (Tabela 3.1), 50% de solução de hormônios (3,5 mg/L de E1 e E2) e 1,5% de Bacto Agar, dissolvido no meio sintético.

____________________________________________________________________________ Figura 3.3 – Procedimento para seleção de microrganismos utilizando as

culturas obtidas no reator de enriquecimento.

10 mL 2,5 mL Agitação 25 °C 1:1000 1:1000 10 mL 10 mL 100 mL 100 mL 1000 mL 1000 mL 7 d 9 d 2 d 5 d 45 mL meio/ 45 mL sol. hormônios 50% meio/50% sol. hormônios 1,5% Bacto Agar 50% meio/50% solução de hormônios + cultura anterior

500 mL 500 mL 500 mL 500 mL 12 d Incubação 25 °C, 23 d Ensaios de degradação 8 h Repouso a 25 °C, turbulência manual três vez ao dia

Cultura 100 Cultura 25 12 d Incubação 25 °C, 23 d Ensaios de degradação 8 h Cultura 100 Cultura 25

As placas de Petri foram incubadas a 25 ⁰C por aproximadamente cinco dias, até desenvolvimento das colônias. As colônias obtidas foram retiradas do Agar, com o auxílio de um palito estéril, sendo cada colônia transferida para erlenmeyers distintos contendo 5 mL de meio (Tabela 3.1), e 5 mL de solução de hormônios (3,5 mg/L de E1 e E2).

O surgimento da turbidez, indicando o crescimento dos microrganismos, foi constatado após 7, 9 e 12 dias para os volumes de 10, 100 e 1000 mL, respectivamente, conforme Figura 3.3. Cada solução obtida (10 e 100 mL) foi transferida para erlenmeyers contendo uma nova solução composta por 50% de meio e 50% de solução de hormônios (90 e 900 mL).

As soluções obtidas foram denominadas de cultura 25 (proveniente da quantidade inicial de 2,5 mL) e cultura 100 (proveniente da quantidade inicial de 10 mL), sendo que cada cultura foi separada em duas frações. A primeira foi utilizada para avaliar a degradação de hormônios em ensaios aeróbios de curta duração, 8 h. A segunda foi mantida a 25 ⁰C sem aeração, em um erlenmeyers de 1 L, por mais 23 dias, para avaliar a possível degradação dos compostos utilizados durante o cultivo, E2 e E1 (Figura 3.3).

Os ensaios aeróbios de curta duração, realizados com as duas soluções obtidas ao fim do cultivo, foram conduzidos através da aliquotagem em diferentes volumes para cada tempo de ensaio (50 mL para 0 e 1 h; 100 mL para 2 e 4 h; e 200 mL para 8 h). Cada volume foi adicionado a um frasco cônico e a cada frasco foi adicionada uma

quantidade exata de solução de hormônios (400 mg/L dissolvida em metanol), para obter uma concentração inicial de 100 µg/L de E1 e E2. O sistema ficou sob aeração a 25 ⁰C durante o tempo determinado de reação (0, 1, 2, 4 e 8 h), após este período, a amostra foi submetida a filtração e ao procedimento de extração em fase sólida para determinação da concentração de hormônios por HPLC.

3.2.3 Terceira etapa – Avaliação preliminar do biorreator a