Seleção de clones por coloração azul-branco

O vetor plasmidial pBC-SK permite seleção por coloração azul-branco em função da complementação do lacZ M15 em cepas que apresentam esse genótipo,

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X

O X-gal fo

soluções foram armazenadas a em LB ágar por 16

placas e inoculados em me agitação por 16

através da análise fenotípica de cor a antibiótico (cloranfenicol).

da cultura

foram lacradas com adesivo e acondicionadas clone da biblioteca genômica.

e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

Figura 7. Fluxograma das ativi

Funcional (Curvas)

Clones Inteiros

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X

gal foi preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as soluções foram armazenadas a

em LB ágar por 16

placas e inoculados em me agitação por 16

através da análise fenotípica de cor a antibiótico (cloranfenicol).

Após confi da cultura foram

foram lacradas com adesivo e acondicionadas clone da biblioteca genômica.

A partir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

Figura 7. Fluxograma das ativi

Ensaios de Complementação Funcional (Curvas) para confirmar atividade (UVC) Clones Inteiros Análises para predição de

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X

i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as soluções foram armazenadas a

em LB ágar por 16 h a 37 placas e inoculados em me

agitação por 16 h a 37 °C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo através da análise fenotípica de cor

a antibiótico (cloranfenicol).

Após confirmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços foram adicionad

foram lacradas com adesivo e acondicionadas clone da biblioteca genômica.

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

Figura 7. Fluxograma das ativi

Ensaios de Complementação Funcional (Curvas) para confirmar atividade (UVC) ORF- específicos Análises in silico para predição de proteínas

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X

i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as soluções foram armazenadas a - 20 °C. As colônias foram obtidas após incubação a 37 °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das placas e inoculados em meio LB líquido contendo cloranfenicol 25

°C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo através da análise fenotípica de cor (coloração azul e branco)

a antibiótico (cloranfenicol).

rmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços adicionados em 100

foram lacradas com adesivo e acondicionadas clone da biblioteca genômica.

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

Figura 7. Fluxograma das atividades realizadas a partir de clones candidatos. Clones Candidatos in silico para predição de proteínas Confirmar Operon

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X

i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as °C. As colônias foram obtidas após incubação °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das

io LB líquido contendo cloranfenicol 25

°C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo (coloração azul e branco)

rmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços em 100 µL de glicerol 100

foram lacradas com adesivo e acondicionadas a

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

dades realizadas a partir de clones candidatos. Clones Candidatos

proteínas RT-PCR

Confirmar Operon

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB contendo 25 µg/mL de cloranfenicol, 80 µg/mL de X-gal fresco e de 20 mM de IPTG. i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as °C. As colônias foram obtidas após incubação °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das

io LB líquido contendo cloranfenicol 25

°C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo (coloração azul e branco)

rmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços de glicerol 100

a - 80 °C - cada poço representa um

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz ultravioleta, como apresentado adiante (Figura 7).

dades realizadas a partir de clones candidatos. Clones Candidatos proteínas PCR Níveis de Expressão Gênica

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB gal fresco e de 20 mM de IPTG. i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as °C. As colônias foram obtidas após incubação °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das

io LB líquido contendo cloranfenicol 25

°C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo (coloração azul e branco) e teste de resistência

rmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços

% por poço, em seguida cada poço representa um

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz

dades realizadas a partir de clones candidatos.

proteínas Expressão Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) Mutagenicidade gene Diminuição da afinidade do antibiótico = SOBREVIVÊNCIA

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB gal fresco e de 20 mM de IPTG. i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as °C. As colônias foram obtidas após incubação °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das io LB líquido contendo cloranfenicol 25 µg/mL, sob °C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo e teste de resistência

rmação, os clones foram estocados em placas de 96 poços, 100 por poço, em seguida cada poço representa um

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz

dades realizadas a partir de clones candidatos.

proteínas Ensaio de Mutagênese Direta (Rifampicina) Mutagenicidade gene rpoB Diminuição da afinidade do antibiótico = SOBREVIVÊNCIA 26

como a DH10B. A seleção das colônias brancas pode ser obtida em placas de LB gal fresco e de 20 mM de IPTG. i preparado em dimetill formamida e o IPTG em água destilada estéril e as °C. As colônias foram obtidas após incubação °C. Os clones (colônias brancas) foram repicados das µg/mL, sob °C. Foram novamente plaqueados para confirmar genótipo e teste de resistência

100µL por poço, em seguida cada poço representa um

rtir desta biblioteca genômica foram realizados ensaios para identificação e caracterização de clones candidatos envolvidos com resposta ao estresse por luz

dades realizadas a partir de clones candidatos.

Mutagênese Direta

Mutagenicidade Diminuição da

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