Seleção de SNPs e formação de haplótipos

Do total de 777.000 SNPs, 480.556 (61,9%) tinham call rate igual ou

superior a 90%, MAF>0,05 e p para o teste de equilíbrio de Hardy Weinberg maior que 0,001. Espigolan et al. (2012) encontraram 57,3% de SNPs de acordo com os mesmo critérios. Os painéis de SNPs para a genotipagem foram desenvolvidos a partir do genoma de diversas raças, principalmente de raças taurinas, mas também com raças zebuínas, tornando os marcadores mais informativos para

animais da raça taurinas do que para zebuínos, os quais apresentam vários alelos em frequência muito baixa (MAF) (MATUKUMALLI et al., 2009).

O número de SNPs encontrados dentro de cada região dos genes candidatos variou de 0 a 73 (Tabela 3). Após a localização dos SNPs foram montados os grupos de haplótipos (Tabela 4) e então foram feitas as análises estatísticas. Os haplótipos variaram em sua formação de dois a dezesseis SNPs.. Zhang et al. (2003) relataram que em humanos, não há padrão para a quantidade de SNPs por haplótipo.

Tabela 3. Quantidade de SNPs encontrados em cada gene candidato

Gene Número de SNPs Gene Número de SNPs Gene Número de SNPs

ACADL 13 GAST 6 PLIN2 1

ACOX1 10 GCG 2 PPARa 14

ADA 19 GH-1 3 PPARy 16

ADIPOQ 4 GIP 1 PPP3CA 73

ADRB3 1 GRB2 6 PRKACA 2 AGT 4 HGF 12 RAC2 5 AGTRA P 15 IGF1 3 RARRES2 2 Apo-E 0 IL 6 4 RETN 1 BRAF 8 Lep 12 RXRB 1 CCK 5 LLPH 1 SCD 4 CEBPA 0 LPL 9 SERPINE1 0 CFD 3 MAPK1 4 SPP1 2 DGAT 1 2 MAPK3 0 TG 72 DLK1 2 MIF 1 TNF 7 EGF 35 MYC 3 TP53 0

FABP3 15 NAMPT 9 UCP - 1 9

FABP4 3 NPPA 0 UCP - 2 5

Tabela 4. Descrição de Haplótipos (h) por Cromossomo (Crom), com o número de alelos e SNPs formadores de haplótipos e SNPs isolados (SNPi).

Crom 2 Alelo SNP Crom 6 Alelo SNP Crom 7 Alelo SNP Crom 14 Alelo SNP Crom 19 Alelo SNP

h 02-1 3 2 h 06-1 4 3 h 07-1 3 2 h 14-8 3 2 h 19-1 3 2 h 02-2 4 11 h 06-2 4 4 h 07- 2 2 3 h 14-9 5 8 h 19-2 3 2 h 02-3 3 2 h 06-3 4 3 SNPi 1 h 14-10 9 10 h 19-3 2 2 h 02-4 4 3 h 06-4 3 2 Crom 8 Alelo SNP h 14-11 3 2 h 19-4 3 2 h 02-5 3 2 h 06-5 5 4 h 08-1 6 16 h 14-12 7 11 h 19-5 4 7 h 02-6 3 2 h 06-6 3 2 SNPi 1 h 14-13 2 2 h 19-6 3 6 h 02-7 2 2 h 06-7 4 3 Crom 13 Alelo SNP h 14-14 3 2 SNPi 5 h 02-8 3 2 h 06-8 4 4 h 13-1 3 2 SNPi 11 Crom 21 Alelo SNP

SNPi 4 h 06-9 5 6 h 13-2 4 4 Crom 15 Alelo SNP h 21-1 3 2

Crom 4 Alelo SNP h 06-10 7 13 h 13-3 3 2 h 15-1 6 6 SNPi 0

h 04-1 4 4 h 06-11 4 7 h 13-4 4 6 h 15-2 5 4 Crom 22 Alelo SNP

h 04-2 7 10 h 06-12 4 4 h 13-5 3 2 SNPi 0 h 22-1 6 5 h 04-3 4 9 h 06-13 3 2 h 13-6 4 5 Crom 16 Alelo SNP h 22-2 2 2 h 04-4 3 4 h 06-14 4 4 SNPi 1 h 16-1 4 6 h 22-3 2 2 h 04-5 4 7 h 06-15 6 8 Crom 14 Alelo SNP h 16-2 6 9 SNPi 14

SNPi 13 h 06-16 3 4 h 14-1 3 2 SNPi 0 Crom 23 Alelo SNP

Crom 5 Alelo SNP h 06-17 6 8 h 14-2 3 2 Crom 17 Alelo SNP h 23-1 4 3

h 05-1 3 2 h 06-18 3 2 h 14-3 6 8 h 17-1 3 3 h 23-2 4 3 h 05-2 3 5 h 06-19 4 5 h 14-4 3 2 h 17-2 4 4 SNPi 2 h 05-3 4 5 h 06-20 8 11 h 14-5 3 2 h 17-3 3 2 Crom 26 Alelo SNP

h 05-4 2 4 h 06-21 3 2 h 14-6 3 3 SNPi 5 h 26-1 2 4 h 05-5 2 2 SNPi 9 h 14-7 7 15 SNPi 0

SNPi 5 Crom 28 Alelo SNP

h 28-1 3 2

4.3 Análises estatísticas

As análises estatísticas revelaram, após a correção pelo método de Bonferroni, que apenas dois haplótipos formados por dois e quatro SNPs localizados nos genes

FABP4 e PPP3CA e um SNP isolado no gene PPP3CA tiveram efeito significativo ao

nível de p<0,05 para a característica de precocidade sexual em bovinos da raça Nelore. Os demais SNPs isolados e haplótipos estudados não tiveram efeito significativo sobre a característica avaliada, incluindo-se entre estes um terceiro SNP também localizado no gene FABP4 e 68 SNPs localizados no gene PPP3CA. Destes 68

SNPs, 63 formaram 10 haplótipos e os outros 5 foram estudados isoladamente. As

Tabelas 4 e 5 apresentam os alelos encontrados no rebanho estudado, seguindo as normas para determinação de alelos "Top/Bot" da Illumina® (Illumina Technical

Support, 2006).

Os haplótipos significativos localizados nos genes FABP4 e PPP3CA correspondem aos haplótipos localizados no cromossomo 14 e 6, os quais de denominam haplótipos h14-14 e h06-14 (Tabela 4). Os SNPs do h14-14, cromossomo 14 e gene FABP4 estão localizados nas posições 46833778 e 46837361 com identificação HD 1400013256 e HD 1400013257. O SNP isolado no cromossomo 6 no gene PPP3CA está localizado antes do h06-14 com localização 24935878 e identificação HD 0600006865. Os SNPs do h06-14, cromossomo 6 e gene PPP3CA estão localizados nas posições 24944828, 24949691, 24955087 e 24960820 com identificação HD 0600006867, HD 0600006868, HD 0600006869 e HD 0600006870.

Tabela 5. Frequências e efeito médio do alelo e respectivo erro padrão, dos alelos do haplótipo localizado no gene FABP4

Alelo Bases dos SNPs

Frequência Efeito Médio Erro Padrão

Alelo1 AA 0,547 0,0088 0,0616

Alelo2* CA 0,343 0,3081 0,0662

Alelo3* CG 0,110 - 0,3170 0,0902

* efeito médio significativamente diferente de zero (P<0,05).

Tabela 6. Frequências e efeito médio do alelo e respectivo erro padrão, dos alelos do haplótipo localizado no gene PPP3CA

Alelo Bases dos SNPs

Frequência Efeito Médio Erro Padrão

Alelo1 AAAA 0,094 0,035 0,146 Alelo2* GGGG 0,539 0,263 0,092 Alelo3* GAGA 0,284 0,428 0,106 Alelo4* GGGA 0,084 -0,727 0,152 SNP isolado Alelo1* A 0,176 -0,164 0,037 Alelo2* G 0,824 0,164 0,037

* efeito médio significativamente diferente de zero (P<0,05).

5. Discussão

O efeito do haplótipo formado por dois SNPs, localizados na região do gene

FABP4 foi significativo (P<0,05) indicando que este polimorfismo, pode ter efeito direto

sobre a precocidade sexual. O haplótipo apresenta três alelos (Tabela 8), sendo um praticamente neutro e os dois outros com sinais opostos. Como o erro padrão das estimativas foi relativamente grande, a confiança no efeito médio é baixa. O alto valor do erro padrão se deve ao baixo número de animais utilizados no experimento. Um terceiro SNP deste mesmo gene, porém em equilíbrio de ligação com os dois SNPs,

não mostrou efeito significativo sobre a característica. Não foram encontrados relatos na literatura relacionando os efeitos de polimorfismos no FABP4 diretamente sobre a precocidade sexual. Entretanto, Hoashi et al. (2008) encontraram efeito significativo de polimorfismos deste gene com a porcentagem de colesterol C16:1 que, segundo Lauber et al. (1993) e Nelson & Cox (2002) funciona como precursor de hormônios esteróides, que, por sua vez têm efeitos diretos sobre órgão reprodutivos.

Os ácidos graxos livres, transportados pelo FABP4, podem ser ativados e oxidados para produzir o acetil-CoA e NADH e parte deste acetil-CoA é utilizada para a biossíntese do colesterol. Os esteroides, produzidos a partir do colesterol são responsáveis por modular a diferenciação, o crescimento e a fisiologia dos órgãos reprodutivos (NELSON & COX, 2002; HAVLIKOVA et al., 2006; FERRETTI et al., 2008; KRESGE et al., 2009).

Outra via indireta pela qual os polimorfismos no gene FABP4 podem estar associados à precocidade sexual é por meio da leptina. Há relatos de que esse gene (FABP4) foi localizado dentro de alguns loci de características quantitativas (QTL) da região que contribuem para os níveis séricos de leptina em ratos (OGINO et al., 2003). Há muitos estudos que relacionam a leptina com a precocidade sexual (MOORE et al., 2003; WU et al., 2005; LEW, 2006; SALMAN & COSTA 2006; BELTRAN, 2007 ; FURLAN et al., 2007; FERNYHOUGH et al., 2007; VAICIUNAS, 2007). Entretanto, é interessante notar que o gene da Leptina foi incluído neste estudo, com 12 SNPs polimórficos, que foram analisados como 9 SNPs isolados e um haplótipo formado por três SNPs, não sendo detectado efeito significativo sobre a característica de interesse.

O haplótipo localizado no cromossomo 6, na região do gene PPP3CA, formado a partir de quatro SNPs teve efeito significativo (P<0,05) sobre a característica de interesse. O haplótipo apresenta quatro alelos (Tabela 8), sendo um praticamente neutro, dois com sinal positivo e o último com maior valor possui sinal negativo. Como o erro padrão das estimativas foi relativamente grande, a confiança no efeito médio é baixa. Há um SNP estudado isoladamente com dois alelos que também apresentou efeito significativo. Como o erro padrão das estimativas foi relativamente grande, a confiança no efeito médio é baixa. Os outros 68 SNPs desse gene que foram

estudados isoladamente ou formadores de haplótipos não tiveram efeito significativo sobre a precocidade sexual.

Não há relatos na literatura correlacionando o gene PPP3CA com a precocidade sexual em machos ou fêmeas, porém Martin et al. (2007) ao analisarem ratos, constataram que quando este gene é inativadoproblemas de desenvolvimento testicular e redução das espermátides maduras ocorrem. Desse modo, os mesmos autores concluíram que esse gene é criticamente importante na espermatogênese e no desenvolvimento testicular. Silva et al. (1999) relataram em bovinos da raça Nelore que, animais que iniciam cedo a sua atividade sexual devem apresentar um desenvolvimento testicular adequado.

O gene PPP3CA está envolvido com a diferenciação de pré-adipócitos da gordura perimuscular em bovinos (TANIGUCHI et al., 2008). Os pré-adipócitos são capazes de diferenciar-se em adipócitos maduros, sendo que adipócitos são células responsáveis pelo armazenamento de gordura (FRAYN et al., 2003; COSTA & DUARTE, 2006; FONSECA-ALANIZ et al., 2006). Além disso, a diferenciação dos pré- adipócitos em adipócitos maduros está associada há um aumento dos níveis de IGF-I no organismo (WAJCHENBERG, 2000). Há relatos na literatura de que o gene responsável pela expressão do IGF-I está relacionado com a precocidade sexual (LEW, 2006; BELTRAN, 2007; ISLAM et al., 2009; MICKE et al., 2010). Neste estudo trabalhou-se com três SNPs neste gene, sendo que destes dois SNPs formam um haplótipo e o outro foi estudado isoladamente, porém não se detectou efeito significativo sobre a característica de interesse.

Não foram encontrados na literatura consultada relatos de polimorfismo de outros genes que estão ligados com o metabolismo do tecido adiposo e que tenham efeito sobre a precocidade sexual.

6. Conclusão

Os genes FABP4 e PPP3CA influenciam a precocidade sexual e, podem desse modo, serem considerados em programas de seleção que visem melhorias na precocidade sexual de animais da raça Nelore.

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