Seleção do PI

Em tubo de extração foram transferidos 25 µL de solução padrão do fármaco, 25 µL da solução de PI a ser testada e o solvente foi evaporado sob fluxo de ar comprimido. Foi adicionado 1 mL de plasma branco previamente centrifugado e os tubos foram agitados por 30 segundos em mixer, em seguida foram adicionados 200 µL de NaOH 1mol/L, 4 mL do solvente extrator e os tubos foram novamente agitados por 2 minutos em mixer. Após isto o procedimento de extração seguiu como descrito na figura 8.

As soluções testadas como PI foram: cimetidina 10 µg/mL, fluoxetina 80 µg/mL, oxibutinina 400 µg/mL, diazepam 1 mg/mL, amitriptilina 1 mg/mL, cloridrato de lidocaína 50 µg/mL, acetaminofeno 1 mg/mL e propranolol 1mg/mL.

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3.3. VALIDAÇÃO

O protocolo de validação do método baseou-se na resolução 899, de 29 de maio de 2003, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003).

3.3.1. Calibração e Linearidade

Em tubos de extração foram transferidos 25 µL das soluções-padrão do fármaco, 25 µL da solução do PI e o solvente foi evaporado sob fluxo de ar comprimido. Foi adicionado 1 mL de plasma branco e os tubos foram agitados em

mixer por 30 segundos. Estas amostras de plasma enriquecidas, preparadas em

triplicata para cada nível de concentração, foram submetidas ao procedimento de extração descrito na figura 8 e analisadas por CE.

O gráfico de calibração foi construído plotando-se no eixo das abscissas a concentração plasmática do fármaco 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 e 5,00 µg/mL e no eixo das ordenadas a razão entre a área do fármaco e a área do PI.

A linearidade do método foi avaliada como descrito acima, porém contemplou as concentrações plasmáticas de 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 e 5,00 µg/mL.

3.3.2. Limite de Quantificação (LQ)

O LQ foi estabelecido através da análise de 5 amostras de plasma branco enriquecidas com solução-padrão do fármaco na concentração plasmática de 0,125 µg/mL e submetidas ao procedimento de extração descrito na figura 8.

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3.3.3. Recuperação

Para avaliar a eficiência do procedimento de extração foi realizada a análise do fármaco nas concentrações plasmáticas especificadas abaixo, omitindo-se a etapa de extração. Em tubos cônicos de vidro foram transferidos 25 µL das soluções-padrão do fármaco contemplando as concentrações baixa, média e alta da faixa de linearidade do método (0,50, 2,00 e 5,00 µg/mL) e 25 µL da solução de PI. O solvente foi evaporado até a secura sob fluxo de ar comprimido, o resíduo foi reconstituído em 50 µL de solução metanol/água (30:70) e analisado por CE.

Amostras de plasma (n=5) enriquecidas com solução-padrão do fármaco e PI, nas mesmas concentrações descritas acima, foram preparadas segundo o procedimento de extração descrito na figura 8. O resíduo foi reconstituído em 50 µL de solução metanol/água (30:70) e analisado por CE.

A recuperação do fármaco e do padrão interno foi calculada comparando-se os resultados obtidos das soluções-padrão não extraídas com as amostras de plasma enriquecidas que passaram pelo procedimento de extração, de acordo com seguinte fórmula (CAUSON, 1997):

Recuperação (%) = resposta do analito na matriz (amostra processada) x 100 resposta do analito no padrão (não processado)

3.3.4. Precisão e Exatidão

Para avaliar a precisão e exatidão inter e intraensaio foi feito um gráfico de calibração, no intervalo de concentração plasmática de 0,25 a 5,00 µg/mL em duplicata, conforme procedimento de extração descrito na figura 8. Para o estudo da precisão e exatidão foram preparadas amostras de plasma branco enriquecidas com 25 µL das soluções-padrão do fármaco, contemplando as concentrações baixa, média e alta do intervalo linear do método (0,50, 2,00 e 5,00 µg/mL), e estas

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submetidas ao procedimento de extração descrito na figura 8. As amostras foram preparadas em sextuplicata para cada nível de concentração.

A precisão e a exatidão interensaio foram avaliadas durante três dias consecutivos e a precisão e exatidão intraensaio foram avaliadas no mesmo dia.

Os cálculos para avaliar a precisão do método foram feitos usando-se o gráfico de calibração e as dispersões em relação aos valores médios foram expressas como coeficiente de variação (CV):

CV% = desvio padrão x 100 média

A exatidão foi expressa como a porcentagem de erro em relação a concentração teórica e calculada segundo a fórmula (CAUSON, 1997):

Exatidão (%) = (concentração média experimental – concentração teórica) x 100 concentração teórica

3.3.5. Estabilidade

3.3.5.1. Estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento

Amostras de plasma branco enriquecidas com 25 µL de solução-padrão do fármaco nas concentrações baixa e alta da curva de calibração (0,50 e 5,00 µg/mL) foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento da seguinte maneira: foram congeladas à temperatura de -20 °C e mantidas por 24 horas, sendo então submetidas ao descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as amostras foram novamente congeladas por 24 horas e assim sucessivamente até completarem os três ciclos. As amostras foram preparadas em sextuplicata para cada concentração.

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Após os ciclos as amostras foram enriquecidas com o PI e passaram pelo procedimento de extração (descrito na figura 8) e os resultados obtidos foram comparados com aqueles obtidos em amostras recém-preparadas e extraídas.

3.3.5.2. Estabilidade de curta duração

As amostras de plasma branco enriquecidas com 25 µL do fármaco nas concentrações de 0,50 e 5,00 µg/mL, preparadas em sextuplicata, foram mantidas a temperatura ambiente por um período de 12 horas. Após este tempo as amostras foram acrescidas da solução do PI e submetidas ao procedimento de extração (figura 8). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados de amostras recém–preparadas e extraídas.

3.3.5.3. Estabilidade de longa duração

O estudo de estabilidade de longa duração foi feito para um período de sete dias.

Amostras de plasma branco, preparadas em sextuplicata, enriquecidas com 25 µL de solução-padrão do fármaco nas concentrações baixa e alta da curva de calibração (0,50 e 5,00 µg/mL) foram mantidas congeladas à -20 °C. Após uma semana estas amostras foram descongeladas à temperatura ambiente, acrescidas da solução do PI e submetidas ao procedimento de extração descrito na figura 8. Os resultados obtidos foram comparados com aqueles de amostras recém preparadas e extraídas.

Os dados obtidos nos estudos de estabilidade foram analisados estatisticamente pelo teste de análise de variância (ANOVA).

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