Seletividade

A seletividade é um dos requisitos mais importantes na validação de uma metodologia analítica. É a capacidade de o método identificar de forma assertiva o analito estando ele contido ou não na matriz ou solução padrão. Para muitos instrumentos analíticos, como na cromatografia há a necessidade de se comprovar o grau de separação, utilizando-se para isso uma substância padrão.

Para métodos quantitativos a seletividade deve ser apresentada como sendo exclusivamente do analito, sem possíveis interferentes de produtos de sua degradação, reatividade, efeito matriz, impurezas ou interferência do solvente de diluição. (Anvisa, 2017).

4.7.2 Recuperação

A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo (em Inglês, Spike), em pelo menos três diferentes concentrações. A recuperação, em termos de porcentagem, é calculada segundo a equação 4 (INMETRO, 2003):

𝑅(%) = massa obtida

massa real 𝑥 100 (Equação 4)

4.7.3 Linearidade

Linearidade é a definição para um método analítico em obter um sinal ou resultado diretamente proporcionais à concentração de um analito na amostra. Uma curva analítica adequada apresentará uma faixa de linearidade em um determinado intervalo de concentração. Deve apresentar proporcionalidade para diferentes níveis de concentração do analito de uma amostra.

A relação das duas variáveis (Sinal / Concentração) é normalmente obtida pela equação 5.

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (Equação 5)

Onde:

y = sinal registrado (Área do pico); x = concentração;

a = inclinação da curva analítica; b = interseção com o eixo y.

A ocorrência da linearidade deve ser oriunda de no mínimo 5 pontos de concentrações distintas a partir da solução padrão preparadas em triplicata de forma independente, podendo também ser diluída de uma mesma solução padrão.

Os cálculos envolvidos na avaliação da linearidade devem ser realizados com valores reais e seus respectivos sinais analíticos. As informações devem ser apresentadas na forma de um gráfico com o sinal em função de cada concentração do analito obtido, dispersão de resíduos também na forma gráfica detalhando toda a avaliação estatística, equação da reta dos eixos (x) e (y) e suas regressões lineares fazendo uso do método dos mínimos quadrados, coeficientes de correlação (r) e de determinação (r2), avaliação da significância do coeficiente angular, homocedasticidade ou igualdade das variâncias dos dados e o melhor modelo estatístico adequado à metodologia em validação, uso do nível de significância de 5%, coeficiente de correlação acima de 0,990 e coeficiente angular significativamente diferente de zero (Inmetro, 2016).

As curvas analíticas utilizadas para quantificação dos analitos podem ser obtidas pelo método do Padrão Externo e método do Padrão Interno. No método do Padrão Externo, a curva é obtida utilizando as áreas dos picos versus as concentrações teóricas. Idealmente uma curva analítica deveria ser uma reta que cruza a origem, com isso facilmente teríamos a equação da reta com um coeficiente de correlação (r2) igual ou próximo a (r = 1,000). No entanto, a prática do preparo de uma curva analítica não é tão simples assim, normalmente há a necessidade do analista de “tratar” dados provenientes de coeficientes lineares negativos ou positivos.

A adição de um reagente padrão interno a amostra tem por finalidade a normalização dos “sinais” respostas de uma curva analítica, minimizando assim erros

sistemáticos no preparo das diluições dos analitos padrões, assim como erros provenientes de injeções manuais ou automáticas (Ligiero et al., 2009). A curva é obtida dividindo a área do padrão pela área do padrão interno versus a concentração.

Abaixo são detalhados alguns requisitos e critérios um bom preparo de um padrão interno na cromatografia:

• O pico do reagente padrão interno deve eluir próximo ao tempo de retenção dos picos de interesse;

• O pico deve estar bem resolvido no cromatograma;

• O composto deve ser quimicamente semelhante aos analitos de interesse e não interferir ou reagir com quaisquer analitos da amostra;

• Como qualquer outro padrão, o padrão interno deve estar disponível em alta pureza.

4.7.4 Exatidão

A exatidão é a medida exata de um método analítico, ou o valor mais próximo do medido e do valor que é aceito. A exatidão é medida com a percentagem do analito recuperado em uma amostra fortificada com concentração conhecida.

Para se confirmar a exatidão, o guia de metodologia do International Conference on Harmonization ICH recomenda a coleta de no mínimo 9 determinações, com no mínimo três níveis de concentrações distintas em triplicatas cada uma. Os dados devem ser reportados como a percentagem recuperada da concentração do analito fortificado subtraído do analito presente na matriz, ou pela diferença entre o valor médio e valor verdadeiro com seus intervalos de confiança, (Inmetro, 2016).

De forma conceitual a Exatidão é obtida pelo teste de recuperação conforme equação:

4.7.5 Precisão

Precisão é a medida do grau de repetibilidade e reprodutibilidade de um método analítico sob condições normais de operação e normalmente é descrita como a percentagem do desvio padrão relativo (RSD, em inglês Relative Standard Deviation). A precisão pode ser avaliada a partir da repetição da leitura de amostras, amostras semelhantes ou padrões com um número de amostras estatisticamente significante.

De acordo com o ICH, a precisão deve também ser avaliada pela repetibilidade e reprodutibilidade. Repetibilidade se refere ao resultado operacional em um curto período sob as mesmas condições (mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo instrumento sob as mesmas condições de trabalho), pode se dizer que é a máxima diferença aceitável entre duas repetições, (sendo executadas de forma independentes, do mesmo ensaio e no mesmo laboratório) (Leite, 1996).

A precisão intermediária refere-se a variações decorrentes da mesma análise, só que em dias diferentes, realizadas por diferentes analistas, diferentes equipamentos ou a interação desses fatores. Esta medida da precisão é reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um único laboratório e, como tal, mais aconselhável de ser adotada. O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar se no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados ao final do procedimento.

A reprodutibilidade refere-se aos resultados colaborativos entre laboratórios, para sua avaliação deve-se informar: o desvio padrão, desvio padrão relativo, coeficiente de variação e intervalo de confiança (Swartz e Krull, 1997). A reprodutibilidade é a máxima diferença aceitável entre dois resultados individuais, para cada um dos laboratórios, para um mesmo processo e com demais condições (Resultados interlaboratoriais), (Leite, 1996).

4.7.6 Limite de Detecção (LD)

O limite de detecção (LD) é definido como a menor concentração de um analito na amostra que pode ser detectado, embora não necessariamente quantificado. É um teste limite que especifica se um analito está acima ou abaixo de um determinado valor. É expresso como uma concentração em um sinal especificado para a relação sinal / ruído, usualmente a uma taxa de 2 ou 3 para 1 (Swartz e Krull, 1997). Na prática o LD é calculado como sendo correspondente a concentração que produziria um valor do sinal medido 3 vezes maior que o nível de ruído médio medido com a solução de controle ou branco e segundo os autores o critério geralmente indica um nível de confiança de 95% (Leite, 1996).

A Conferência Internacional sobre Harmonização (ICH) reconhece a convenção da relação sinal-ruído, no entanto outras duas opões para a determinação do LD são: o Método Visual Não Instrumental (MVNI) e o cálculo das médias. Métodos visuais não instrumentais podem incluir técnicas tais como cromatografia em camada fina ou a titulação. O LD também pode ser calculado com base no desvio padrão (DP) da inclinação da curva analítica (sensibilidade) em níveis próximos do LD de acordo com a Equação 6 (Swartz e Krull, 1997).

𝑳𝑫 = 3,3 𝐷𝑃

𝐼𝐶𝐴 (Equação 6)

DP = Desvio Padrão

ICA = Inclinação da Curva Analítica

O desvio padrão da resposta pode ser determinado com base no desvio padrão do branco, ou no residual padrão da regressão linear, ou ainda no desvio padrão da regressão linear do eixo Y.

Segundo a (Anvisa, 2017) o cálculo do LD pode ser realizado pela razão sinal-ruído, através do método visual, ou através de parâmetros da curva analítica comparada com a determinação da média dos brancos e fundamentado na características do método analítico adotado.

4.7.7 Limite de Quantificação (LQ)

O limite de quantificação (LQ) é definido como a menor concentração do analito em uma amostra que possa ser determinado com precisão e exatidão sobe as condições operacionais declaradas no método. Assim como o LD, o LQ é expresso em concentração, juntamente com a precisão e exatidão relatadas. Algumas vezes a relação sinal / ruído 10 para 1 pode ser utilizada para determinar o LQ, desde que esteja associado a precisão e exatidão (Swartz e Krull, 1997).

Limite de Quantificação também chamado de limite de determinação, é o menor valor determinado, em confiabilidade de precisão e exatidão aceitáveis, para aquela condição analítica. Para o LQ considera-se que não se atingiu o limite da técnica/método ou do equipamento (Leite, 1996).

A (Figura 11) ilustra a Razão Sinal/Ruído para Limite de Detecção e Limite de Quantificação.

Figura 11 - Razão Sinal/Ruído para Limite de Detecção e Limite de Quantificação

5. MATERIAL E MÉTODOS