4- MATERIAIS E MÉTODOS
4.2.1 Seletividade
A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa (Ribani et al, 2004). No presente trabalho, a análise dos compostos pesquisados foi realizada monitorando-se íons selecionados (SIM- Selected Ion Monitoring) em alta resolução (< 10.000 com incerteza de 20ppm). A seletividade foi obtida pelos tempos de retenção na cromatografia líquida e pelos cromatogramas de íons das espécies protonadas e
52 deprotonadas em alta resolução. Assim tem-se uma metodologia altamente seletiva, visto que apenas os íons de interesse numa faixa muito restrita (± 20ppm) são monitorados e detectados pelo analisador de massas.
4.2.2 – Ajuste de curva analítica/Linearidade e faixa de trabalho
O ajuste de curva analítica/linearidade de um método analítico é a capacidade de obter resultados proporcionais às concentrações dos analitos nas amostras (ICH, 2005). Os modelos de calibração utilizadas foram baseados em regressões quadráticas obtidas por padronização externa, onde foram realizadas injeções de sete replicatas dos padrões nas concentrações de 5, 10, 30, 50, 100, 130, 200 e 250µg/L em metanol, para obtenção das curvas analíticas. Os ajustes das curvas/linearidade foram avaliados com base nos gráficos de distribuição normal dos resíduos e o coeficiente de correlação que segundo o INMETRO, um valor de r maior que 0,90 é aceitável.
4.2.3 - Limite de Detecção/Limite de quantificação
Segundo a ANVISA (2003) o limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas. O LD pode ser calculado de três maneiras diferentes: método visual, método relação sinal-ruído e o método baseado em parâmetros da curva analítica (Ribani et al, 2004). Neste estudo para determinação do LD foi utilizado o método de relação sinal/ruído. Para tal, foi feita a análise dos padrões em baixas concentrações e os valores de LD foram calculados usando um aplicativo no software do equipamento. Foram consideradas para a estimativa dos limites de detecção do equipamento as concentrações de padrão cuja relação sinal/ruído fosse maior que 3. O procedimento experimental adotado para determinação do LQ foi idêntico ao citado anteriormente para o LD, entretanto, foram considerados como limite de quantificação as concentrações de padrão cuja relação sinal/ruído fosse maior que 10. Vale destacar que para o cálculo do LD do método assim como do LQ do método também foram considerados o fator de concentração da amostra, o índice de recuperação e o efeito da interferência da matriz.
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4.2.4 – Precisão
A precisão é a medida da concordância entre os valores experimentais de ensaios independentes, repetidos de amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas. Normalmente esta medida é expressa pelo desvio-padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) para resultados de valores de concentrações conhecidos. A precisão do equipamento foi avaliada em termos de repetibilidade através do cálculo do coeficiente de variação (CV) para um número de sete repetições de padrões preparados em metanol, onde foram aceitos CV de até 20%, dependendo do nível de concentração da amostra (INMETRO, 2007). A precisão do método também foi avaliada em termos de repetibilidade em ensaios de recuperação, onde foram utilizadas 3 amostras de esgoto fortificadas para uma concentração final de 100ng/mL.
4.2.5 - Exatidão
A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (INMETRO, 2007) Segundo Ribani (2004), os processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são os materiais de referência, ensaios de recuperação, adição de padrão e comparação de métodos. A recuperação está relacionada com a exatidão, pois indica a quantidade de determinado analito recuperado no processo em relação à quantidade real contida na amostra (Silva, 2010).
A limitação do procedimento de recuperação é a de que a substância adicionada não está, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra. Isso pode implicar, por exemplo, na presença de substâncias adicionadas em uma forma que proporcione melhor recuperação e detecção, ocasionando avaliações excessivamente otimistas da recuperação. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem interferir na separação, detecção ou na quantificação da substância, efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados. Devido a esse fato nos cálculos do ensaio de recuperação também foram considerados o efeitos no sinal dos analitos pela matriz. Os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de resíduos geralmente estão entre 70 e 120%, com precisão de até ± 20%. Porém, dependendo da complexidade analítica e da amostra, este valor pode ser de 50 a 120%, com precisão de até ± 15% (Ribani, 2004).
54 No presente estudo, a exatidão foi avaliada através do ensaio de recuperação. Foi utilizado um volume de 100mL de amostras de esgoto que foram previamente fortificadas para uma concentração final de 100ng/mL de todos os compostos. As amostras fortificadas foram posteriormente extraídas de acordo com o procedimento de extração já descrito no item 4.1.3 (terceiro teste). As análises foram realizadas em triplicata. A porcentagem de recuperação foi calculada de acordo com a equação 4.2
% de recuperação = [(C1- C2) / C3] x 100 (4.2)
onde:
C1 = concentração determinada na amostra fortificada; C2 = concentração determinada na amostra não fortificada; C3 = concentração adicionada.
4.3 - Terceira etapa: Monitoramento em amostras reais diversas etapas
em sistemas simplificados de tratamento de esgoto
4.3.1 - Área de estudo e Amostragem
As amostras de esgoto foram coletadas do Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) da UFMG, contígua à estação de tratamento de esgotos (ETE) da bacia do ribeirão Arrudas, em Belo Horizonte. Essa ETE recebe grande parte do esgoto sanitário gerado pela região metropolitana de Belo Horizonte e uma pequena fração é retirada para alimentar as unidades experimentais, após o esgoto bruto passar pelo tratamento preliminar (gradeamento e desarenação). O sistema de esgoto investigado consiste de reator UASB (reator anaeróbio de fluxo ascendente) seguido por lagoas de polimento e reator UASB seguido por Wetland não plantada.
Foram realizadas 12 coletas em dias distintos no período de junho a agosto de 2010. Em cada ponto foi coletado 10L de amostra de forma composta em período de 24 horas. As amostras foram coletadas nos pontos designados P1 (esgoto sanitário após tratamento preliminar), P2 e P4 (efluentes de reatores UASB), P3 (efluente do sistema wetlands) e P5 (efluente da Lagoa de Polimento). A Figura 4.8 ilustra os pontos de coleta.
55 Figura 4.8: Esquema dos pontos de coleta
Após o período de amostragem, foi retirada uma alíquota de cerca 300 mL que, em seguida, foi filtrada em filtros de celulose de 8 µm e em seguida em filtros de fibra de vidro de 0,7 µm. Depois de filtradas, as amostras foram extraídas e analisadas no HPLC/MS/MS conforme procedimento descrito no item 4.1.3 (terceiro teste).