Seletividade

A seletividade do método foi checada na solução diluente, na amostra contendo stigmurina, nas soluções de stigmurina que passaram por degradação térmica, fotólise, hidrólise ácida (HCl) e hidrólise básica (NaOH), no tempo de degradação e concentração de degradação otimizadas, durante o estudo de degradação forçada. O espectro UV para identificação de stigmurina e o grau de pureza do pico cromatográfico foram determinados. Varreduras espectrais foram obtidas de 200 a 400 nm pelo detector de arranjo de fotodiodos, operando no modo de varredura total e, em seguida, selecionou-se o comprimento de onda de 215 nm para o estudo.

4.2.14.2 Linearidade

A curva de calibração foi realizada em triplicata pela preparação de solução padrão de stigmurina em diferentes concentrações, preparadas de maneira independente, a fim de se obter as concentrações finais de 0,8, 0,9, 1,0 1,1 e 1,2 mg.mL-1_{. A curva de calibração foi obtida pela obtenção do gráfico da razão da área} do pico de stigmurina versus a concentração.

Para avaliação da linearidade, foi obtida uma curva de calibração através da representação gráfica das respostas (ÁREA DO PICO DA STIGMURINA) em função da concentração do analito, o gráfico de dispersão dos resíduos, acompanhado de sua avaliação estatística, e a equação da reta de regressão de y em x, estimada pelo método dos mínimos quadrados, uma avaliação da associação linear entre as variáveis por meio do coeficientes de correlação (r) e de determinação (r²) e uma avaliação da significância do coeficiente angular.

A homocedasticidade dos dados foi ser investigada para a utilização do modelo adequado, em um nível de significância de 5% (cinco por cento), o coeficiente de correlação > 0,99, e o coeficiente angular deve ser significativamente diferente de zero.

4.2.14.3 Limite de detecção (LD)

A determinação do limite de detecção foi realizada por estimativa a partir dos dados da curva analítica de calibração (desvio padrão residual da linha de regressão) e confirmada pela preparação e leitura de uma solução a 0,04 mg.mL-1_{, a partir da} diluição da solução padrão nominal a 1,0 mg.mL-1 _(100%).

4.2.14.4 Limite de quantificação (LQ)

A determinação do limite de quantificação foi realizada por estimativa a partir dos dados da curva analítica de calibração (desvio padrão residual da linha de regressão) e confirmada pela preparação e leitura de uma solução a 0,14 mg.mL-1_{, a} partir da diluição da solução padrão nominal a 1,0 mg.mL-1 _{(100%), cuja precisão e} exatidão foram determinadas, devendo o limite de recuperação encontrar-se na faixa de 80% - 110% e o DPR% das análises variar no máximo 5%.

4.2.14.5 Exatidão

A Exatidão é determinada por meio do grau de concordância entre os resultados individuais do método em estudo em relação a um valor aceito como verdadeiro.

Para determinação da exatidão foram utilizadas triplicatas de soluções amostra, preparadas de maneira independente, nas concentrações baixa (0,8 mg.mL- 1 _{– 80%), média (1,0 mg.mL}-1 _{– 100%) e alta (1,2 mg.mL}-1 _{– 120%) e os resultados} foram expressos em recuperação média.

A exatidão foi expressa pela relação percentual de recuperação do analito de concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a concentração

média, determinada experimentalmente, e a concentração teórica correspondente, dada pela equação seguinte:

Recuperação = Concentração média experimental

Concentração teórica × 100

4.2.14.6 Repetibilidade

Para determinação da repetibilidade a solução de trabalho foi preparada, 6 réplicas, na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 _{(100%), individualmente} preparadas, sob as mesmas condições de operação, mesmo analista e mesma instrumentação, em uma única corrida analítica. Os resultados foram expressos em DPR%.

4.2.14.7 Precisão Intermediária

Para determinação da precisão Intermediária a solução de trabalho foi preparada em sextuplicata, na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 _{(100%), em dois} dias diferentes, por dois analistas distintos, denominados analista A e B. Os valores foram expressos em DPR% e análise estatística de teste T de Student em par para médias foi realizada.

4.2.14.8 Robustez

Para determinação da robustez do método foram preparadas soluções de trabalho na concentração nominal de 1,0 mg.mL-1 _{(100%) e realizadas pequenas} mudanças deliberadas em três fatores da condição cromatográfica padronizada, a saber: temperatura do forno (39°C e 41°C), proporção de fase móvel (41%:59% – FMA:FMB e 43%:57% – FMA:FMB) e fluxo de fase móvel (0,29 mL.min-1 _{e 0,31} mL.min-1_{). Os resultados foram expressos em DPR%.}

4.2.14.9 Adequabilidade do sistema

Para determinação da adequabilidade do sistema avaliou-se as condições de operação do equipamento, método e coluna cromatográfica com base no pico cromatográfico para stigmurina. Os dados de adequabilidade do sistema foram obtidos para as análises de repetibilidade e expressos em DPR%. Os valores de área, N, HETP, K, Tf, Res, Pureza de pico e tR foram calculados através do software LC Solution, Shimadzu®_.

4.2.14.10 Estabilidade das soluções

Para avaliação da estabilidade preparou-se uma solução de trabalho na concentração nominal de 100% (1,0 mg.mL-1_{) e procedeu-se sua injeção, três vezes} nos tempos 0, 12, 18 e 24h. A presença de picos adicionais àqueles presente no tempo zero, bem como a diminuição das áreas dos picos foram avaliadas.

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQMed) na Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN.

5 RESULTADOSEDISCUSSÃO

5.1 CARACTERIZAÇÃO DA STIGMURINA

5.1.1 Caracterização dos grupos químicos e morfologia do pó de stigmurina

O espectro FTIR da stigmurina no estado sólido é apresentado na Figura 8(A). O espectro. de peptídeos e proteínas, apresenta algumas regiões de vibração bem características, são elas: Amida A, Amida I, Amida II e Amida III. Sendo a região da Amida I a mais sensível às alterações conformacionais estando sua frequência correlacionada com a estrutura secundária e sendo, portanto, bastante utilizada na caracterização de estrutura secundária de peptídeos e proteínas (BAL RAM, 1999; SPEED; KING; WANG, 1997).

Figura 8 - Espectro FTIR (A) e imagem MEV (B) para stigmurina em estado sólido

Fonte: Autoria própria, 2019.

Duas características são proeminentes no espectro da stigmurina: uma banda larga de absorção em 3290 cm-1_{, conhecida como Amida A, e uma banda de absorção} em 1649 cm-1_{. A atribuição deste último é bem conhecida: a faixa a 1620-1700 cm}-1 refere-se à amida I (principalmente modo de estiramento do grupo C=O de carbonila); a banda a 1539 cm-1 _{(amida II) também está bem estabelecida: refere-se ao modo de} deformação no plano do grupo NH. As bandas de modo deformacional dos grupos amina de cadeia lateral carregada NH3+ _{também estão no intervalo em 1500 cm}−1_,

como por exemplo, para zwitterion de alanina no estado sólido (ROZENBERG et al., 2003).

Evidências qualitativas extensivas correlacionam frequências de absorção de amida características com a presença de α-hélices (1650 cm-1_{), folhas-β (1620 cm}-1 _e 1680 cm-1_{) e estruturas randômicas (1640-1650 cm}-1_{) (SUSI; TIMASHEFF; STEVENS,} 1967). No estado sólido os dados FTIR sugerem que stigmurina se estabilize entre α- hélices e/ou estruturas randômicas visto não serem observadas vibrações características para folhas-β.

A banda em 3068 cm-1 _{é atribuída a vibração dos grupos NH3}+ _{da cadeia lateral.} A atribuição desta banda ao modo NH3+ _{também é suportada pela presença de uma} banda a 3000 - 3100 cm-1 _{em espectros de cristal de peptídeos simples e aminoácidos} (ROZENBERG et al., 2005), que formam zwitterions com o grupo NH3+ _{no estado} sólido. As bandas estreitas em 2964 cm-1_{, 2927 cm}-1 _{e 2870 cm}-1 _{são atribuídos aos} modos de estiramento CH2.

Adicionalmente a imagem MEV, Figura 8(B), de stigmurina pó apresenta morfologia pouco definida e bastante heterogênea, com presença de estruturas esféricas e bastões, organizados em forma de teia, e partículas desagregadas de superfície lisa.

5.1.2 Perfil de impurezas de síntese para stigmurina

Inicialmente foram caracterizadas as impurezas na amostra de stigmurina estudada, uma vez que esta foi sintetizada com 98% de pureza. Em virtude de proteínas e peptídeos normalmente sofrerem protonação as análises LC-TOF/MS foram realizadas no modo positivo.

A Figura 9 apresenta o cromatograma de íons totais (TIC) e os espectros de massas para cada uma das substâncias observadas na análise do padrão de stigmurina. Foram detectados três picos com tempos de retenção (tR) de 17,35 min; 17,66 min e 17,84 min (Figura 9A).

Figura 9 - Cromatograma de íons totais (TIC) para stigmurina evidenciando impurezas (A) e espectro de massas para tR = 17,84 (B), tR = 17,66 (C) e tR = 17,35 (D)

(A)

(B)

(C)

(D)

Fonte: Autoria própria, 2019.

[M+H]+ [M+2H]2+ [M+3H]3+ [M+H]+[M+3H]+ [M+3H]3+ [M+2H]2+ [M+H]+ [M+H]+ [M+Na]+ [M+K]+ [M+Na]+ [M+2H]2+ [M+Na]+ [M+H]+ [M+2H]2+ [M+3H]3+

Em 17,84 min (Figura 9B) encontra-se os íons com m/z de 599,3566,898,5328 e 1.796,0556 que correspondem à stigmurina triplamente protonada, duplamente protonada e protonada, respectivamente. Também encontramos uma m/z de 2.394,4007 correspondente a ligação entre a forma protonada e triplamente protonada da stigmurina. Este peptídeo apresenta massa molecular monoisotópica de 1.795,1713 Da, erro 0,62 ppm (C89H139N19O20).

Em 17,66 min (Figura 9C) encontra-se os íons com m/z de 855,0142; 1.709,0192; 1.731,0005 e 1.745,9704, que correspondem à impureza 1 duplamente protonada, protonada, formando aduto com íon sódio e com íon potássio, respectivamente, o que indicaria que a massa molecular média da impureza 1 seria 1.708,011375 Da (C84H129N17O19), erro 0,49 ppm. A diferença entre os valores de m/z para as formas protonada da stigmurina e impureza 1 de aproximadamente 87 Da sugere deleção de um resíduo de serina. Na estrutura linear da stigmurina o resíduo de serina está em 3 diferentes posições e, portanto, a impureza 1 pode ser uma das seguintes sequências: FFLIPSLVGGLISAFK-NH2; FFSLIPLVGGLISAFK-NH2 ou

FFSLIPSLVGGLIAFK-NH2.

Ainda em 17,66 min também se encontra íons com m/z de 599,6836; 899,0228; 1.797,0339 e 1.819,0131, que correspondem à impureza 2 triplamente protonada, duplamente protonada, protonada e formando aduto com sódio, respectivamente, o que indicaria que a massa molecular da impureza 2 seria 1.796,0260 (C89H138N18O21), erro 0,31 ppm. A proximidade de massa molecular com a stigmurina divergindo em 0,98402 sugere que a impureza 2 trata-se da forma não- amidada da stigmurina (Figura 10), também presente na amostra e co-eluindo com a impureza 1.

Figura 10 - Proposta de estrutura química para impurezas 2 Impureza de síntese 2: FFSLIPSLVGGLISAFK - m/z: 1797,0339

+H OH NH NH NH NH N NH NH NH NH NH NH NH NH NH NH N H₂ O O O OH O CH₃ CH3 O CH3 CH₃ O O OH O CH3 CH3 O CH3 C H3 O O O CH3 CH3 O CH3 CH3 O OH O CH3 O NH O NH2

Fonte: Autoria própria, 2019.

Em 17,35 min (Figura 9D) encontra-se íons com m/z de 561,6624; 841,9868; 1.682,9652 e1.703,9438, que correspondem à impureza 3 triplamente protonada, duplamente protonada, protonada e formando aduto com íon sódio, respectivamente, o que indicaria que a massa molecular média da impureza 3 seria 1.682,0136 Da (C85H129N17O20), erro 4 ppm. A diferença entre os valores de m/z para as formas protonada da stigmurina e impureza 3 de aproximadamente 113 Da sugere deleção de um resíduo de isoleucina ou leucina, que são isômeros. Na estrutura linear da stigmurina os resíduos de leucina se encontram em 3 diferentes posições enquanto os de isoleucina se encontram em 2 diferentes posições.

5.1.3 Caracterização térmica

O entendimento das alterações pós aquecimento que a stigmurina sofre e que podem levar a alterações de suas propriedades é crucial para o desenvolvimento de suas aplicações. Inicialmente foram obtidas curvas DSC e TG em atmosfera de N2 para stigmurina, conforme apresentado na Figura 11.

Figura 11 – Sobreposição de curvas DSC e TG para stigmurina em atmosfera de N2 (A) e

imagens DSC-fotovisual a 30°C, 100°C, 140°C, 160°C, 190°C, 230°C e 360°C (B).

(A)

(B)

Fonte: Autoria própria, 2019.

A stigmurina apresentou quatro etapas de perda de massa, na curva TG, na faixa de 30°C – 900°C e apenas eventos endotérmicos, totalizando quatro eventos, na faixa de 30°C – 450°C, relacionados as etapas de perda de massa. As duas perdas de massa que se iniciam à temperatura ambiente e finalizam a 170°C estão possivelmente relacionadas com perda de água e solventes ainda presentes na amostra. Estas etapas de perda de massa envolvem a presença de dois eventos endotérmicos. O primeiro evento (Tonset = 25°C e ∆Hevap = 40,5 J.g-1_{) e o segundo} evento (Tonset = 135°C) pouco definido envolvendo possível desvio da linha de base. As etapas de perda de massa superiores a 180°C trata-se de decomposição propriamente dita da stigmurina (Ti = 184°C; 1° etapa e, Ti = 257°C; 2° etapa) e envolve processos endotérmicos (Figura 11A).

As imagens DSC-Fotovisual (Figura 11B) não evidenciam alteração visual da amostra até 160°C, no entanto na imagem a 190°C pode-se observar presença de amostra em estado líquido possivelmente devido a formação de produtos de decomposição. A 232°C observa-se que a coloração da amostra se encontra levemente amarelada e, a 360°C evidencia-se escurecimento da amostra e formação de material com contornos alaranjado.

Uma vez evidenciado alteração da linha de base durante a curva DSC, sabendo-se que a presença de solventes de síntese poderiam estar interferindo na visualização deste evento e, sendo determinada a temperatura de início da decomposição procedeu-se obtenção de curvas DSC em ciclos no modo de aquecimento-resfriamento-aquecimento entre temperatura ambiente e 180°C (primeiro e segundo ciclo) e -50 a 180°C (resfriamento), como apresentado na Figura 12.

Figura 12 – Curvas DSC para ciclo aquecimento-resfriamento em atmosfera de nitrogênio (A) e curva DRX para stigmurina (B)

Fonte: Autoria própria, 2019

Na Figura 12(A), o primeiro aquecimento da stigmurina (iniciando em temperatura ambiente revelou um evento endotérmico relacionado a perda de água a Tonset = 34,08 °C e ∆Hevap = 55,93 J.g-1 _{e um segundo evento endotérmico não bem} definido a Tonset = 137 °C. Após resfriamento da amostra um segundo aquecimento foi realizado onde se observou um desvio da linha de base com Tg = 149°C (ponto médio) típico de material amorfo confirmando que a amostra não cristaliza na etapa de

resfriamento. De fato, nenhum pico de recristalização foi encontrado durante o resfriamento, conforme Figura 12(A).

Finalmente padrão de dados DRX foram usados para confirmar que a amostra sendo analisada seria amorfa. Materiais amorfos não apresentam uma estrutura ordenada como materiais cristalinos e, portanto, o padrão de difração resultante não possui série típica de picos associados a materiais cristalinos. O padrão de difração de materiais amorfos associados com materiais apresenta um amplo "halo" com poucos ou um único máximo, conforme visualizado na Figura 12(B) para stigmurina obtida por síntese química na faixa de 2 θ – 40 θ. Embora este halo padrão não identifique unicamente o material em estudo ele confirma que o material é amorfo, sendo fundamental a sua caracterização. Três sinais fortes característicos de fase silício-carbono estão presentes, após 40θ (44θ, 64θ e 77θ). Estes picos coincidem com a fase carbeto de silício (SiC), conforme identificado por comparação com a carta padrão #JPCDS 49-1623. Adicionalmente, uma análise FRX foi realizada e verificado presença de átomo de Silício na amostra.

Após a etapa final de síntese química dos peptídeos, seja em solução ou em fase sólida, o peptídeo bruto deve ser purificado por técnicas cromatográficas, como: troca iônica, exclusão, afinidade e / ou reversa (MACHADO et al., 2004; MANT et al., 2018; XU et al., 2018). A cromatografia líquida de fase reversa é baseada na adsorção dos peptídeos sintéticos a uma matriz estacionária hidrofóbica (derivada de sílica pela introdução de cadeias alquílicas tais como n-butil (C4), n-octil (C8), n-octadecil (C18), fenil, ciclo-hexil e outros) (FIELD et al., 2019). Portanto, é possível detectar o carbeto de silício (SiC), oriundo de etapa de síntese ou purificação, juntamente com o padrão de Stigmurina em análises de DRX acima de 40θ.

A presença de uma transição vítrea evidencia o fato do peptídeo stigmurina apresentar região amorfa, com uma falta de ordem, semelhante ao da proteína elastina (SAMOUILLAN et al., 2002). A determinação da temperatura de transição vítrea é importante para o desenvolvimento da formulação de stigmurina no futuro, pois, em geral, a estabilidade de longo prazo de uma formulação contendo proteínas/peptídeos requer que a temperatura de armazenamento esteja bem abaixo da temperatura de transição vítrea, além da possibilidade do uso da temperatura de transição vítrea na realização de estudos de compatibilidade fármaco-excipiente (LU et al., 2007). Stigmurina pode ser, portanto, considerado um peptídeo com alto valor de temperatura de transição vítrea (Tg > 100) (FABIO et al., 2015).

5.2 CARACTERIZAÇÃO DOS VOLÁTEIS LIBERADOS PELA STIGMURINA DURANTE DECOMPOSIÇÃO EM ATMOSFERA DE NITROGÊNIO E AR SINTÉTICO

5.2.1 Análises TG-FTIR

A Figura 13 (A) apresenta a perda de massa (TG), associada a curva derivada DTG e perfil de absorbância total no infravermelho (Curva Gram-Schmidt) da stigmurina como uma função da temperatura para atmosfera de N2.

Em atmosfera de nitrogênio, Figura 13(A), a curva TG apresenta 4 etapas distintas de perda de massa. A primeira etapa ocorre da temperatura ambiente a cerca de 93°C com pico de baixa intensidade e pequena perda de massa de 2,8%. A segunda etapa ocorre entre 93°C – 184°C com perda de massa de 4,1%. A terceira etapa ocorre entre 184°C – 254°C com perda de massa de 12%. A quarta etapa ocorre entre 254°C – 497°C com perda de massa de 70,3%. Depois desta stigmurina mantém-se perdendo massa lentamente de maneira constante, com eliminação de material carbonáceo, ao final de 900°C a perda de massa é de 99,1%, com 0,9% de resíduo.

A perda de massa de vários α-aminoácidos alifáticos (metionina, treonina, e alanina) ocorre praticamente em uma única etapa com quase 100% de perda de massa (RODANTE; MARROSU, 1990; RODANTE; MARROSU; CATALANI, 1992), para leucina a perda de massa está relacionada a sublimação do aminoácido que posteriormente decompõem-se no estado gasoso (LI et al., 2006), a glicina é um α- aminoácido que apresenta múltiplos passos de decomposição (LI et al., 2007), para aminoácidos aromáticos tais como tirosina e fenilalanina essa perda de massa ocorre em duas etapas (JIE; YUWEN; JINGYAN, 2008). Devido à complexidade da estrutura de peptídeos e a presença de aminoácidos aromáticos (no caso a fenilalanina) a decomposição em múltiplos passos foi observada para stigmurina.

Figura 13 – Curvas TG, DTG e Gram-Schmidt para stigmurina em atmosfera de N2 (A) e ar

sintético (B) (A)

(B)

A comparação da curva Gram-Schmidt com a curva DTG indica que a temperatura dos picos de absorbância no IR corroboram com aquelas dos picos de DTG apenas para a terceira etapa de perda de massa. A curva Gram-Schmidt apresenta 5 picos a 212 °C, 229 °C, 241 °C, 250 °C e 357°C, e a curva DTG apresenta 3 picos a 132,7 °C, 230,2 °C e 310,1 °C. A terceira etapa de perda de massa na curva DTG envolve três picos máximos da curva Gram-Schmidt. Provavelmente indicando três perfis de voláteis liberados durante esta etapa.

Em atmosfera de ar sintético, Figura 13(B), a curva DTG mostra 5 etapas de perda de massa. A primeira etapa ocorre entre a temperatura ambiente a 83°C com pico amplo de baixa intensidade e pequena perda de massa de 1,8%. A segunda etapa ocorre entre 83°C – 180°C com perda de massa de 4,2%. A terceira etapa ocorre entre 180°C – 254°C com perda de massa de 11,2%. A quarta etapa ocorre na faixa de 254°C - 467°C com perda de massa de 60,8%. Em temperaturas elevadas, acima de 467°C, a quinta etapa de perda de massa ocorre (467°C – 900°C) com perda de massa contínua de 20,3% e, na curva Gram-Schmidt, um pico adicional é observado, sugerindo que produtos gasosos continuam a ser liberados devido a decomposição e oxidação de resíduos. Ao final temos uma massa residual de 1,6%.

Apenas os valores de temperatura de pico para a terceira etapa de perda de massa entre a curva Gram-Schmidt (225°C) e curva DTG (229,6°C) apresentaram similaridade quando comparamos a decomposição da stigmurina em N2 e ar sintético. Em ar sintético, a curva Gram-Schmidt apresenta picos as temperaturas de 215°C, 225°C, 247°C, 340°C e 597°C, enquanto a curva DTG apresenta apenas três picos referentes a perda de massa as temperaturas de 45°C, 162°C, 227°C, 311°C e 585°C. Provavelmente, independente da atmosfera, devido à pequena quantidade de voláteis liberados nos estágios iniciais de perda de massa, o sinal DTG não foi observado na curva Gram-Schmidt. Sugerimos que a perda de massa observada na primeira e segunda etapa, em ambas atmosferas, se deva à umidade e solventes decorrentes do processo de síntese em quantidade pouco significativa para curva Gram-Schmidt. Além disso, na terceira etapa de perda de massa, a temperatura de pico na Gram-Schimdt envolve um pico principal e picos secundários que sugerem diferentes perfis de voláteis liberados na mesma etapa de decomposição.

O comportamento térmico de aminoácidos tem sido estudado e suposições acerca dos gases liberados durante a decomposição foram feitas (RODANTE; MARROSU; CATALANI, 1990; RODANTE; MARROSU, 1992; RODANTE; 1992). Em

se tratando de estudos TG-FTIR, existem dados para glicina, fenilalanina e tirosina para os quais o mecanismo de degradação foi elucidado, bem como para alguns dipeptídeos da glicina (JIE; YUWEN; JINGYAN, 2008; LI et al., 2007). Existem muitos aminoácidos cujos mecanismos de decomposição ainda não foram estudados e isto dificulta a compreensão do mecanismo de decomposição para os peptídeos e proteínas que os apresentam. Logo, como o número de resíduos de aminoácidos em peptídeos e proteínas variam, a complexidade das reações que estão ocorrendo durante o processo de decomposição aumenta, tornando a determinação exata do mecanismo de decomposição pouco provável. Apesar disso é possível encontrar estudos sobre decomposição térmica de peptídeos e proteínas (CUCOS; BUDRUGEAC, 2014b; FONTANARI et al., 2012; TUDORACHI; CHIRIAC, 2011), mas a rota de degradação não é determinada.

O peptídeo deve adquirir instabilidade para que qualquer reação de decomposição ocorra. Quando a estabilidade de homopeptídeos de glicina contendo até 5 resíduos deste aminoácido foi avaliada, constatou-se que o aumento da cadeia peptídica estava relacionado com o aumento da estabilidade térmica (SMITH; ALI; SOLDATOV, 2014), sendo, portanto, peptídeos do aminoácido em questão menos estáveis que seus di-, tri- ou tetra- peptídeos correspondentes.

A Figura 14 apresenta o gráfico de superfície 3D para os gases liberados em ambas as atmosferas produzidos a diferentes temperaturas. Os três eixos representam o número de onda, unidade de absorbância e temperatura do processo, respectivamente. A partir destes foram coletados espectros FTIR com base nas temperaturas das curvas Gram-Schmidt e DTG nas temperaturas de 45 °C, 132 °C, 230 °C, 318 °C e 632°C, para atmosfera de N2, como apresentado na Figura 14(C) e ar sintético 14(D).

Figura 14 – Gráfico de superfície 3D para espectro FTIR dos gases liberados produzidos pela pirólise da stigmurina: em atmosfera de N2 (A) e ar sintético (B), e os respectivos espectros

extraídos em (C) e (D)