Seletividade

A seletividade do método foi avaliada a partir de espectros UV registrados para soluções com e sem adição do reagente de complexação (solução metanólica de cloreto de alumínio hexahidratado a 12 % m/v), no intervalo de 200 a 800 nm. A seletividade do método foi avaliada em 420 nm, comprimento de onda utilizado na leitura. Para que o método seja considerado seletivo, a solução sem adição do reagente de complexação não deve apresentar nenhuma absorção significativa em 420 nm, indicando que a matriz não apresenta interferentes para quantificação do complexo formado.

4.11.3 Linearidade

Pesaram-se exatamente, cerca de 3 mg de quercetina (substância de referência) e transferiu-se para balão volumétrico de 25 mL utilizando metanol para dissolver e completar o volume do balão. Pipetou-se uma alíquota (15 mL) dessa solução para outro balão de 25 mL e completou-se o volume com metanol. Essa foi denominada solução estoque do padrão. Alíquotas de 4,0 mL, 4,5 mL, 5,0 mL, 5,5 mL e 6,0 mL da solução estoque do padrão foram pipetadas, separadamente, para balões volumétricos de 25 mL. Em cada balão adicionaram-se 0,6 mL de ácido acético glacial, 10 mL de solução piridina:água (2:8 v/v) e 2,5 mL de solução metanólica de AlCl3.6H2O a 12 % m/v. Completou-se o volume com água e as concentrações das

soluções finais constam na Tabela 10 (pag 110). Homogeneizou-se e as misturas foram deixadas em repouso por 15 minutos. Transferiram-se as misturas para tubos falcon de 50 mL e centrifugaram-se a 5.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para cubetas de quartzo e após 30 minutos da adição do AlCl3 foi

O líquido de compensação foi obtido transferindo-se 5 mL de metanol para balão volumétrico de 25 mL e adicionando-se 0,6 mL de ácido acético glacial, 10 mL de solução piridina:água (2:8 v/v) e 2,5 mL de solução metanólica de AlCl3.6H2O a 12 %

m/v. Completou-se o volume com água. Homogeneizou-se e a mistura foi deixada em repouso por 15 minutos. Transferiu-se a mistura para tubo falcon de 50 mL e centrifugou-se a 5000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para cubeta de quartzo e esta solução foi utilizada como líquido de compensação.

Foram construídas três curvas analíticas em diferentes dias. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados e os coeficientes de correlação linear (r2_{) de cada curva foram} calculados. As curvas obtidas foram comparadas estatisticamente por análise de covariância (ρ < 0,05). Para análises estatísticas foi utilizado o programa GraphPad Prism 5 (2007).

4.11.4 Precisão

A precisão foi avaliada em dois níveis: precisão intradia e precisão interdia.

Para determinação da precisão intradia foram analisadas seis amostras do mesmo lote de EICS frente a uma solução padrão de quercetina. Cerca de 2,5 g do EICS foram exatamente pesados em sextuplicata e procedeu-se ao preparo das soluções de leitura seguida de leitura em espectrofotômetro conforme descrito no método (item 4.10.1). Calculou-se o DPR para as réplicas (n = 6).

Na determinação da precisão interdia os fatores de variação testados foram tempo (dias) e analista. Foram analisadas doze amostras do mesmo lote de EICS, frente a duas soluções padrão de quercetina (uma solução padrão para cada dia). O procedimento foi executado em dois dias diferentes (seis análises em um dia e seis análises no outro dia), com um intervalo de sete dias entre as análises, e por dois analistas diferentes. Calculou-se o DPR % para as réplicas (n = 12).

De acordo com os critérios da ANVISA (BRASIL, 2003)o DPR deve ser ≤ 5,0 % para que o método seja considerado preciso.

4.11.5 Exatidão

Para determinação da exatidão foi utilizado o método de adição de padrão. O método consiste na adição de quantidades conhecidas da substância de referência quercetina a EICS, com o objetivo de determinar a porcentagem de recuperação.

Pesaram-se nove amostras com exatamente, cerca de 1,25 g de EICS. Adicionaram- se às três primeiras amostras exatamente cerca de 1,3 mg de quercetina padrão, com o intuito de contemplar o intervalo linear de baixa concentração (80% da concentração teórica do teste ou 0,0115 mg/mL). Às outras três amostras foram adicionados exatamente cerca de 1,9 mg de quercetina padrão, com o intuito de contemplar o intervalo linear de média concentração (100% da concentração teórica ou 0,0144 mg/mL). E, finalmente, às três últimas amostras, adicionou-se exatamente, cerca de 2,5 mg de quercetina padrão de, com o intuito de contemplar o intervalo linear de alta concentração (120% da concentração teórica do teste ou 0,0173 mg/mL).

Procedeu-se à análise de cada amostra conforme descrito no item 4.10.1.

A exatidão foi expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, conforme a fórmula abaixo:

Exatidão = concentração média experimental x 100 concentração teórica

4.11.6 Robustez

A robustez do método foi avaliada variando-se três parâmetros considerados críticos para a metodologia: o tempo de leitura, o comprimento de onda de leitura e a concentração da solução de cloreto de alumínio. Cada parâmetro foi avaliado em triplicata, e o resultado comparado com a análise de EICS utilizando as condições nominais descritas no item 4.10.1. Os resultados obtidos em cada condição foram comparados com os resultados adquiridos nas condições nominais por análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey (ρ< 0,05).

A variação dos parâmetros foi realizada como segue:

 Tempo de leitura: três amostras do mesmo lote foram preparadas conforme descrito no item 4.11.1 e as leituras foram realizadas em 420 nm, 25, 30 e 35 minutos após adição do AlCl3.

 Comprimento de onda: três amostras do mesmo lote foram preparadas conforme descrito no item 4.11.1 e as leituras foram realizadas 30 minutos após adição do AlCl3, em 418, 420 e 422 nm.

 Concentração da solução de AlCl3: três amostras foram preparadas

conforme descrito no item 4.11.1 e, para cada amostra foi utilizada solução metanólica de AlCl3.6H2O nas concentrações de 10, 12 e 14% m/v.

4.11.7 Limite de quantificação

O limite de quantificação foi determinado a partir dos parâmetros da curva analítica, de acordo com a equação:

LQ = 10 * DPi / IC

Onde DPi é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo 3 curvas de

4.11.8 Limite de detecção

O limite de quantificação foi determinado a partir dos parâmetros da curva analítica, de acordo com a equação:

LD = 3,3 * DPi / IC

Onde DPi é o desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo 3 curvas de

calibração e IC é a inclinação da curva analítica (ICH, 1994 e 1996).