Sensores e biossensores in vivo e in vitro

Espécies reativas de oxigénio e azoto desempenham um importante papel nos meios biológicos, no entanto, o mecanismo através do qual este processo se desenrola é pouco conhecido e naturalmente controverso [59]. Como tal, não é de admirar que o número de publicações com novos sensores e/ou biossensores tenha aumentado exponencialmente nos últimos anos [9, 27, 59]. O resultado deste crescente interesse é o desenvolvimento de inúmeras moléculas capazes de responder, através da alteração de uma característica mensurável, à presença das espécies reativas de oxigénio e azoto (Fig.1.4). A maioria destas moléculas foram adaptações de moléculas biológicas com mecanismos de ação já conhecidos. A interação entre as espécies reativas e o sensor pode ser através de: uma reação de oxidação redução, um mecanismo não seletivo para as espécies reativas de oxigénio e azoto, visto estas serem fortes oxidantes, ou uma outra afinidade química qualquer.

Figura 1.4 – Representação da estratégia de deteção para o peróxido de hidrogénio recorrendo à metodologia de proteína específica. Adaptado de [60].

Neste trabalho dá-se particular atenção aos estudos realizados in vivo apoiados em técnicas de fluorescência, uma técnica não invasiva e bastante sensível. No entanto, não é fácil criar um sensor para funcionar em condições citoplasmáticas. De facto, um biossensor para medições in vivo deve ser: solúvel em água, permeável à membrana celular, não tóxico e excitável em comprimentos de onda que não causem reação química nem autofluorescência, ou seja, deverá ser excitável acima dos 450 nm. Adicionalmente deverá possuir boas propriedades fotofísicas e excelentes características de deteção, tal como a seletividade, ser facilmente capturado pela célula, ter boa difusividade e reversibilidade. Além de tudo isso, deve responder em tempo real e ter uma qualquer proporcionalidade manuseável e de fácil utilização com a concentração da espécie reativa [21].

1.3.1. Sensores de espécies reativas de azoto

Atualmente são várias as estratégias que têm vindo a ser adotadas para desenvolver sensores bastante sensíveis e seletivos para as espécies reativas de azoto. O oxido nítrico tem sido um dos analitos mais explorados no interior de células vivas e através do qual se tem obtido bons resultados [61-62]. Por outro lado, também têm sido usados sensores baseados em proteínas [63] ou mesmo recorrendo a tecnologias emergentes como nanotubos [64], no entanto, os sensores mais comuns são constituídos por uma molécula orgânica juntamente com um metal. Embora os fluoróforos orgânicos tenham grandes desvantagens para a deteção in vivo, como baixa intensidade de fluorescência e fotoestabilidade, inércia química ou fotobranqueamento, o seu uso para detetar espécies reativas em células tem sido amplamente usado e tem-se obtido alguns casos de sucesso [21]. Os sensores baseados em compostos orgânicos apresentam a grande vantagem de se poder quantificar o analíto, normalmente por extinção da fluorescência, devido à forte dependência da fluorescência com a concentração.

Um dos primeiros casos de sucesso para espécies reativas de azoto foi o fluoróforo fluoresceína. Conhecida pelo seu grande rendimento quântico, a fluoresceína mostrou-se bastante sensível, no entanto, a intensidade de fluorescência está muito dependente do valor de pH do meio, bem como, a sua elevada fotodegradação, o que levou à procura de outros fluoróforos orgânicos. Como tal,

livres nas diaminas vicinais, o que altera significativamente a energia do grupo aromático e uma vez sequestrados, por exemplo, pelo óxido nítrico, ocorre a extinção da fluorescência da o-fenilenodiamina e dos seus derivados [21]. Aliás, esta teoria da transferência de eletrões fotoinduzidos que extinguem a fluorescência de um qualquer fluoróforo que contenha dois grupos anima consecutivos é relativamente aceite [68], por exemplo, a molécula vicinal diaminobenzoacridina reage com o óxido nítrico e é usada com muito sucesso para mapear os macrófagos [69].

Apesar do facto de alguns fluoróforos orgânicos serem bons sensores para espécies reativas de azoto, estas moléculas apresentam o problema de não reagirem reversivelmente e de, frequentemente, reagirem de forma indireta com o analito [21]. Alternativamente existem os sensores compostos por uma molécula orgânica e um metal. Estes possuem a vantagem de reagir diretamente com o analíto, através de um processo de oxidação-redução entre a espécie reativa e o catião metálico que por sua vez condiciona a fluorescência da molécula. Uma outra vantagem desta classe de sensores é a capacidade de reagir reversivelmente. Ao longo dos anos têm sido usados vários metais na constituição destes sensores organometálicos, nomeadamente, os catiões cobre, ruténio, ródio ou o ferro [70]. De todas as possibilidades exploradas, o cobre parece ser o mais promissor, uma vez que é um metal versátil que permite medições diretas em tempo real e no interior de células vivas. Um exemplo de um sensor organometálico baseado em cobre é o ácido cobre- (2-{2-cloro-6-hidroxi-[(2-metil-quinolina-8-ilamina)-metil]-3-oxo-3H-xanteno-9-il}-

benzoico, em que o catião cobre, que se encontra complexado na estrutura da quinolina, é reduzido pela ação direta do óxido nítrico a cobre(I) e ocorre então um incremento da fluorescência do fluoróforo [71-72]. Este aumento é proporcional à concentração de óxido nítrico, sendo que este sensor é específico.

Uma estratégia recente para melhorar a sensibilidade dos sensores para o óxido nítrico é a retenção celular. De facto, verifica-se que quanto mais tempo o sensor permanecer na célula maior é a sensibilidade e menor o ruído de fundo. Esta estratégia foi desenvolvida quando se descobriu que a retenção celular da calceína, um complexo de fluoresceína, se devia ao grupo iminodiacético. Pelo que ao acoplar um sensor a este grupo aumenta-se a sensibilidade ao analito, mesmo que este se encontre em quantidades vestigiais no interior da célula [73].

Atualmente são inúmeros os exemplos de sensores para espécies reativas de azoto com o recurso a fluoróforos, nomeadamente através do uso de ácido fólico, derivados da calceína ou derivados do boro-dipirrometano, como sensores para o peroxinitrito [73-75] ou sensores com estruturas mais complexas como o manganês(III)-meso-(tetrakis(4-sulfunato-fenil))-porfirina imobilizada em xerogel dopado com dendímeros para monitorizar o ácido nitroso [76]. No entanto, as espécies mais estudadas continuam a ser o óxido nítrico e o peroxinitrito, remetendo para segundo plano todas as restantes espécies reativas de azoto.

1.3.2. Sensores de espécies reativas de oxigénio

O desenvolvimento de sensores para espécies reativas de oxigénio, tal como para as espécies reativas de azoto, começou pelos fluoróforos orgânicos. Um fluoróforo orgânico que tem sido amplamente usado na deteção do peróxido de hidrogénio intracelular, é uma fluoresceína reduzida, a diclorodihidrofluoresceína [20]. Este composto, na forma de sal, penetra facilmente nas células e após sofrer oxidação torna-se fluorescente, podendo ser detetado por várias técnicas fluorescentes como, por exemplo, a microscopia confocal ou citometria de fluxo. O processo é tão simples que se tornou bastante popular para monitorizar espécies oxidantes em células. O mecanismo pelo qual se torna fluorescente na presença de um oxidante, é uma oxidação a dois eletrões e não é específico para o nenhum oxidante que participe com um par de eletrões, como no caso do peróxido de hidrogénio, mas continua, por exemplo, a ser amplamente usado para medir a quantidade peróxido de hidrogénio na forma de stresse oxidativo em células endoteliais [77]. Mesmo com a falta de seletividade, a diclorodihirofluoresceina permite obter informação acerca de outros constituintes, por exemplo a taxa de nitração celular quando se adiciona um qualquer dador de óxido nítrico ao meio citoplasmático pela monitorização do sensor na presença de peróxido de hidrogénio [78]. No entanto, a reação não se ocorre somente com o peróxido de hidrogénio. De facto, a diclorodihidrofluoresceína não é específica, uma vez que outras espécies reativas também têm um potencial oxidativo adequado à oxidação do sensor. Independentemente desta ausência de especificidade, este sensor é usado como medida da capacidade oxidante do meio citoplasmático. Recentemente, surgiram alguns sensores fluorescentes seletivos para o peróxido de hidrogénio, nomeadamente a 3,7-bis(pinacolatoboro)fenoxazina que é oxidada a

despectivos analitos [81-82].

No seguimento da procura de sensores para espécies reativas de oxigénio desenvolveu-se a hidroxifenil fluoresceína, composto não fluorescente que se encontra hoje disponível no mercado. Tal como a diclorodihidrofluoresceína, este composto reage extensivamente com as espécies reativas de oxigénio, segundo um mecanismo de oxidação-redução, e não se mostra específico para nenhuma delas, no entanto, pequenas modificações na sua estrutura podem se mostrar altamente seletivas. Um outro exemplo é o 4[N-metil-N(4-hidroxifenil)amino]-7-nitro-benzofurazano, que não é fluorescente, mas após a reação com radicais peroxilo origina um composto fluorescente [83]. Os sensores para espécies reativas de oxigénio já deram provas de responder a quantidades vestigiais quer in vitro quer in vivo, com um excelente contraste e fora da zona de autofluorescência celular, no entanto, carecem de seletividade porque são sensores essencialmente de oxidação-redução.