Separação do Ácido Hialurônico em Modo Batelada

A separação do AH, em modo batelada, foi avaliada por duas diferentes formas: uma utilizando uma coluna empacotada com uma resina de troca iônica ligada, em série e anterior, à coluna empacotada com gel de exclusão por tamanho, e outra utilizando apenas uma coluna empacotada com gel de exclusão por tamanho. Os géis avaliados foram: Sephacryl S-300HR e Sephacryl S-500HR, as resinas de troca iônica utilizadas foram: Q-

Sepharose Fast-Flow e SP-Sepharose Fast-Flow. Ambas as formas de separação do AH serão detalhadas nos tópicos a seguir.

3.2.4.1. Coluna empacotada com Resina de Troca Iônica em série com uma Coluna empacotada com Gel de Exclusão por Tamanho

Empregando-se uma coluna empacotada com uma resina de troca iônica ligada, em série e anterior à coluna com gel de exclusão por tamanho (Sephacryl S-300HR) foi avaliada, apenas, a coluna preparativa XK 16/20. As dimensões da coluna empacotada com a resina de troca iônica são as seguintes: altura de leito de 8,5 cm e diâmetro interno de 15 mm. Uma vez que a carga residual dos contaminantes protéicos é desconhecida, realizaram- se ensaios utilizando resinas de troca aniônica e catiônica, separadamente.

A resina Q-Sepharose Fast-Flow, trocadora aniônica forte, possui o grupo quaternário de amônio em sua matriz, sendo capaz de reter, através de troca de ânions, os componentes com cargas negativas. A resina SP-Sepharose Fast-Flow, trocadora catiônica forte, detentora do grupo sulfopropil em sua matriz, retém os cátions presentes na amostra. As condições de operação do sistema cromatográfico, para este ensaio, foram: solução de NaNO3 0,1 M como fase móvel, pH 7,0 (mantendo-se a fase móvel neutra de modo a não influenciar na separação), temperatura ambiente, vazão de 1,5 mL/min (considerada como vazão ótima conforme a curva de van Deemter), volume de injeção de 1,5 mL (que corresponde a 5,7% do volume da coluna de exclusão por tamanho) e coluna de vidro empacotada com a resina de troca iônica (com altura de leito de 8,1 cm) ligada em série e anterior à coluna preparativa empacotada com o gel Sephacryl S-300HR, contendo uma altura de leito de 13,0 cm. A concentração inicial da amostra alimentada foi de 0,57 mg/mL para o AH e de 0,21 mg/mL para as proteínas. Alíquotas de 1,5 mL foram coletadas a cada minuto ao longo da corrida cromatográfica para, posterior, análise para determinação da massa molar e, também, para verificação e quantificação de AH e possíveis impurezas proteicas.

3.2.4.2. Coluna empacotada com Gel de Exclusão por Tamanho

Utilizando-se apenas uma coluna empacotada com gel de exclusão por tamanho foram avaliadas as colunas preparativas XK 16/20, XK 16/40 e XK 50/30, separadamente. Tomando-se a coluna XK 16/20 como base, o emprego da coluna XK 16/40 possibilita a avaliação do ensaio de separação com maior altura do leito, e o uso da coluna XK 50/30 permite a averiguação da influência do aumento do diâmetro interno e do aumento da altura do leito, para posterior comparação de dados com a coluna base, no caso XK 16/20. A Figura 3.4 ilustra o aparato experimental do procedimento de separação do AH, em batelada, utilizando apenas a coluna de exclusão por tamanho.

Figura 3.4: Aparato experimental utilizado no ensaio em batelada para a separação do AH empregando-se apenas uma coluna de exclusão por tamanho.

Para os experimentos com a coluna XK 16/20, uma amostra de AH na concentração inicial de 1,10 mg/mL para o AH e de 0,39 mg/mL para as proteínas foi inserida na coluna sob as mesmas condições de operação utilizadas anteriormente no Tópico 3.2.4.1, excluindo-se a coluna de troca iônica. Para as demais colunas, XK 16/40 e XK 50/30, com alturas de leito de 29 e 25 cm, respectivamente, foram calculados a vazão

e o volume de injeção adequado, conforme Equação 2.4, de forma a manter o mesmo ambiente de separação tomando-se como base a coluna XK 16/20, considerando a alteração das dimensões da coluna utilizada. As demais condições operacionais foram mantidas.

Empacotada com o gel Sephacryl S-500 HR, somente a coluna preparativa XK 16/20 foi avaliada. As mesmas condições cromatográficas utilizadas, anteriormente, com o gel Sephacryl S-300HR foram adotadas. Durante todo o período de eluição da corrida cromatográfica, em todos os casos supra mencionados, foram coletadas alíquotas de 1,5 mL a cada minuto para posterior análise de identificação da massa molar, bem como detecção e quantificação de AH e contaminantes protéicos.

3.2.4.3. Saturação do Leito de Gel de Exclusão por Tamanho

Este ensaio foi realizado com o intuito de quantificar a carga mássica máxima, em termos de AH e proteínas, suportada pelo leito de gel. A saturação do leito foi realizada apenas com a coluna preparativa XK 16/20, empacotada com o gel Sephacryl S-300HR. Utilizando-se um sistema cromatográfico, bombeou-se a uma vazão de 1,5 mL/min, inicialmente, uma amostra de AH com uma concentração inicial de 0,10 mg/mL para o AH e de 0,045 mg/mL para as proteínas. A saída da coluna foi monitorada por um detector UV, com comprimento de onda de 280 nm, ligado a um software computacional, o que possibilitou o acompanhamento da corrida cromatográfica ao longo do experimento.

Após a formação de um patamar de equilíbrio, nítido na corrida cromatográfica, a solução de AH foi substituída por uma solução de NaNO3 0,1 M, até a eluição total da amostra remanescente de dentro da coluna. Foram coletadas alíquotas de 1,5 mL a cada minuto durante todo o percurso realizado no experimento, saturação e eluição, para posterior quantificação em relação ao AH e ao teor proteico.