Com o objetivo de melhor conhecermos o gene eae da amostra 1551-2 um fragmento de aproximadamente 3,1 kb (amplificado com os primers AE11 e escD) foi clonado no vetor pMOS. Foram selecionados 3 clones denominados de pISEQ 1, 2 e3. Esses 3 clones foram utilizados para o seqüenciamento de aproximadamente 1077 nucleotídeos pertencentes à região variável do gene eae denominada de Int280 (Frankel et al., 1995). A análise da desses 1077 nucleotídeos seqüenciados revelou 98% de identidade com o gene eae de uma amostra aEPEC do sorotipo O129:H-, pertencente ao subtipo omicron (ο) (Figura 24). Estudos recentes (Blanco et al., 2006) identificaram esse subtipo de intimina (omicron-ο) em outra amostra de aEPEC, sorogrupo não EPEC, do sorotipo O84:H-.
Apesar do subtipo de intimina omicron (ο) ter sido relatado em duas amostras de aEPEC, sorogrupo não EPEC, pertencentes aos sorotipos O129:H- e O84:H-, a ocorrência de AL na ausência de BFP não foi reportada nessas amostras.
Figura 24: BLASTN da seqüência de 1077 nucleotídeos, obtida a partir do
seqüenciamento dos clones pISEQ1, 2 e 3. A análise dos 1077 nucleotídeos da região C-terminal do gene eae da amostra 1551-2 revelou 98% de identidade com o subtipo de intimina omicron (ο).
Discussão
Vários trabalhos vêm demonstrando que BFP, além de ser importante na aderência que precede a aderência mediada por intimina, tem também importante papel na formação das microcolônias bacterianas compactas observadas no padrão AL de tEPEC (Trabulsi et al., 2002). Entretanto, ao caracterizar uma coleção de amostras de aEPEC, não pertencentes aos sorogrupos clássicos de EPEC, Vieira et al. (2001) identificaram 9 amostras que exibiam um padrão de aderência muito semelhante ao padrão AL de tEPEC, exceto pelo fato de ser identificado apenas em ensaios mais prolongados (6 horas) e na ausência de BFP. Como o padrão de aderência mais freqüentemente observado entre as aEPEC é o ALL, onde se formam microcolônias bacterianas mais frouxas do que as do padrão AL (Trabulsi et al., 2002) e, ainda, como as aEPEC compreendem um grupo muito heterogêneo, acreditamos que estudos em subgrupos de amostras que compartilham determinadas propriedades poderiam auxiliar na identificação de novos fatores de virulência e/ou combinações de genes de virulência conhecidos, confirmando seu papel enteropatogênico bem como auxiliando em seu diagnóstico. Assim, neste estudo, inicialmente, buscamos analisar o conjunto de amostras de aEPEC desprovidas de BFP e produtoras de AL comparando diversas características fenotípicas e genotípicas, algumas das quais publicadas anteriormente e outras, obtidas neste estudo.
Até a publicação de Vieira et al. (2001) a ocorrência de microcolônias bacterianas compactas (AL) em amostras de aEPEC desprovidas de BFP não havia sido relatada. Estudos posteriores descreveram a ocorrência de AL na ausência de BFP em algumas amostras de aEPEC do sorotipo O26:H11 (Scaletsky et al., 2005). Nesse
adesina afímbrial que confere o padrão de aderência difusa quando clonado em amostra de E. coli-K12. Porém, os mecanismos pelos quais ocorre a formação de microcolônias bacterianas compactas na ausência de BFP ainda permanecem desconhecidos.
Apesar do fenótipo de aderência comum, demonstramos que as 9 amostras de aEPEC de nossa coleção são diversas com relação aos seus sorotipos, conteúdo plasmidial, e perfil de genes de virulência. O amplo trabalho de caracterização teve o objetivo também de tentar associar a ocorrência de AL com alguma adesina descrita nas diversas categorias de DEC. As adesinas avaliadas por Colony-blot, nas nove amostras produtoras de AL foram: Saa, Paa, ToxB, Iha, Lpf e Lda. Entretanto, nessa caracterização, não pudemos associar a formação de microcolônias bacterianas compactas a nenhuma adesina descrita até o momento. Por essa razão, uma amostra (1551-2) foi selecionada com o intuito de se esclarecer como ocorre a formação de microcolônias bacterianas na ausência de BFP. Essa amostra foi selecionada por ter sido isolada de uma criança com diarréia na ausência de outro patógeno reconhecido, por não apresentar bandas de DNA plasmídial e por ser portadora apenas da adesina intimina entre todos os fatores testados.
Conhecendo a importância do gene eae, que codifica a adesina intimina, a primeira pergunta foi qual seria o papel da intimina na aderência localizada de uma amostra de aEPEC às células HeLa, na ausência de BFP. Com o objetivo de responder essa pergunta, o sistema que utiliza do vetor suicida pJP5603 foi utilizado para obtenção de um mutante não polar no gene eae da amostra 1551-2.
Dados da literatura revelam que a intimina desempenha diferentes papéis quanto a sua importância na aderência às células HeLa. Donnenberg & Kaper (1991) construíram um mutante em intimina da amostra E2348/69 denominado CVD206. Estudos posteriores conduzidos por Cleary et al. (2004) mostraram que a capacidade da
amostra CVD206 de formar microcolônias bacterianas compactas não se encontrava comprometida, mas a sua capacidade em promover o acúmulo dos filamentos de actina, característicos da lesão A/E, avaliado pelo teste de FAS, não pode mais ser observada. Nesse mesmo estudo, os autores demonstraram que essa propriedade só se encontrou comprometida quando os autores utilizaram um mutante em bfpA, denominado UMD901. Esse mutante foi capaz de aderir fracamente às células HeLa, perdendo, assim, a capacidade de promover a aderência localizada característica da amostra selvagem E2348/69. Esses mesmos autores também destacaram a importância de EspA como uma adesina transitória ao utilizar um duplo mutante (bfpA e eae) denominado de UMD886.
Analisando nossos resultados, ao contrário do que foi reportado por Cleary et al (2004), observamos que, na ausência de intimina, a amostra 1551-2 continua aderindo abundantemente às células HeLa, porém em um padrão distinto do observado com amostra selvagem. A amostra 1551-2:eae-, mutada em intima, passou a aderir em um padrão semelhante ao padrão AD, característico da categoria DAEC. Entretanto, o mais importante é ressaltar que a amostra mutada em intimina perdeu a capacidade de forma microcolônias compactas observadas no padrão AL. Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que as microcolônias bacterianas compactas, observadas por microscopia óptica, na realidade, consistem em um processo de internalização totalmente dependente de intimina, e que a ausência desta adesina, embora não tenha comprometido a aderência da amostra às células HeLa, inibiu completamente a formação de microcolônias compactas e, consequentemente, a sua internalização.
Se compararmos esses resultados com os obtidos por Carvalho et al. (2005) em ensaios de inibição de adesão da amostra JPN15 (amostra E2348/69, segregante
observar que, enquanto o bloqueio da intimina, por anticorpo, foi capaz de inibir a aderência dessa amostra à células HeLa o mesmo não foi observado com a amostra utilizada neste estudo, que continuou aderindo a essa linhagem, mesmo na ausência de intimina, embora em um padrão diferente da amostra selvagem.
Uma tentativa de complementação do gene eae da amostra 1551-2:eae- foi realizada utilizando-se o plasmídio recombinante pCVD438, que carreia o gene eae (subtipo α) da amostra E2348/69 (protótipo de tEPEC) (Donnenberg & Kaper 1991). Em ensaios de immunoblot, verificamos que a amostra 1551-2:eae- (pCVD438) teve restaurada a sua capacidade de expressar a proteína de 94 kDa (intimina). Surpreendentemente, quando fomos avaliar o padrão de adesão da amostra complementada, observamos que o subtipo de intimina α não foi capaz de restaurar sua capacidade de formar microcolônias compactas como observado na amostra selvagem 1551-2. A incapacidade de restaurar a lesão A/E poderia estar relacionada com uma incompatibilidade entre a intimina expressa por E2348/69 com a proteína Tir (receptor de intimina, injetado pela bactéria na célula hospedeira) da amostra 1551-2; a ligação de intimina com Tir é que resulta na modulação do citoesqueleto e conseqüente formação da lesão A/E (Knutton et al., 1989).
Como a amostra selvagem teve o seu subtipo de intimina não determinado, entre aqueles que foram testados, resolveu-se então clonar e seqüenciar a região variável do gene eae da amostra 1551-2, que corresponde aos últimos 280 aminoácidos da região C- terminal. Um recente trabalho realizado por Garrido et al. (2006) avalia a existência de aproximadamente 20 subtipos de intimina, com base na tipagem com primers específicos para cada subtipo, localizados dentro dessa região da intimina, que, além de ser variável, corresponde à região que se liga ao receptor Tir. Os dados obtidos com o seqüenciamento da Int280 da amostra 1551-2 revelaram 98% de identidade com o
subtipo de intimina omicron (ο) descrito em duas amostras de aEPEC pertencentes aos sorotipos O129:H- e O84:H- (Garrido et al., 2006; Blanco et al., 2006). Nenhum trabalho da literatura pesquisou até o momento se existe algum envolvimento entre a ocorrência desse subtipo de intimina com padrão AL ou com a capacidade de invadir células HeLa.
A mutação no gene eae revelou não só que a formação de microcolônias compactas é um processo dependente de intimina, como sugeriu a existência de uma nova adesina que medeia uma adesão difusa do mutante em intimina às células HeLa.
Com o objetivo de realizar uma caracterização inicial dessa adesina resolvemos investir na construção de um banco de mutantes não aderentes. Nossa opção por realizar um banco de mutantes e não clonar o referido gene, baseia-se no fato de que a aderência de amostras de DEC tem se mostrado um fenótipo multifatorial e muitas vezes dependente de grandes regiões de DNA cromossômico.
Após a obtenção desse banco de mutantes não aderentes (utilizando o transposon Mini-Tn10), as amostras resultantes foram analisadas quanto à manutenção de sua capacidade de multiplicação pela construção de uma curva de crescimento. Esse cuidado foi tomado com o intuito de avaliar se o fato das bactérias não aderirem às células HeLa poderia estar relacionado com a perda da sua capacidade de adesão ou com algum comprometimento com a sua capacidade de replicação ocasionada pela inserção do transposon em algum gene não propriamente relacionado à aderência da amostra 1551-2.
Um mutante com capacidade normal de multiplicação foi, então, utilizado para a absorção de um soro policlonal produzido com a amostra mutada em intimina. Esse experimento foi conduzido com o objetivo de se evidenciar alguma proteína que
posteriormente, se pudesse averiguar o envolvimento dessa proteína com a adesão difusa da amostra 1551-2:eae-.
Após realizada a etapa de seleção acima descrita foi selecionado, para a continuidade deste estudo, o mutante não aderente 143. O soro absorvido com esse mutante revelou uma banda de aproximadamente 25 kDa que se encontrava presente tanto na amostra selvagem (1551-2) como na amostra mutada em intimina (1551-2:eae- ), mas muito reduzida no mutante não aderente 143. Como muitas adesinas são termorreguladas, fomos averiguar se essa proteína de ~25 kDa também se encontrava ausente quando a amostra era cultivada a 18ºC, condição onde a adesão da amostra 1551-2:eae- encontra-se totalmente comprometida. Pudemos observar que o soro não foi capaz de detectar a presença dessa proteína em extrato total da amostra 1551-2 à 18ºC. Portanto, tem-se aqui duas situações onde a aderência da amostra 1551-2 se encontra comprometida e em que essa proteína de ~25 kDa, encontra-se diferencialmente expressa. Esses dados nos levam a acreditar que essa proteína possa desempenhar importante papel na aderência da amostra 1551-2 às células HeLa em ensaios de 6 horas. Nossa hipótese pode ser reforçada pelo fato do soro absorvido com o mutante não aderente, e que reconhece a proteína de ~25 kDa em ensaios de immunoblot, ser capaz de inibir a aderência da amostra 1551-2:eae- em ensaios de inibição de adesão realizado na presença desse soro.
Até o presente momento, os dados obtidos sugerem que a intimina teria, na amostra selvagem 1551-2, um papel muito mais importante do que o esperado. Poucos ou quase que nenhum trabalho da literatura tem dado muito importância ao processo de invasão observado dentre as EPEC. Consideramos que esse fato não poderia passar despercebido dentro de nosso estudo uma vez que o que encontramos não foram apenas algumas bactérias interiorizadas como conseqüência de um evento não muito bem
esclarecido (conforme se observa na literatura com amostras de EPEC típicas), mas sim, um evento extremamente comum em nosso ensaio. É lógico que também foram observadas bactérias extracelulares, mas que talvez, em ensaios mais prolongados, pudessem também invadir. O que nos chamou a atenção foi o fato da amostra 1551- 2:eae-, mutada em intimina, não demonstrar qualquer tendência à invasão. Devemos ressaltar que, com base no descrito na literatura, a mutação que realizamos em nossa amostra foi direcionada, não provocando alteração em nenhum outro gene que não o da adesina intimina. Com base nessas informações poderíamos atribuir à intimina a capacidade da amostra selvagem 1551-2 em invadir as células HeLa? Acreditamos que para responder essa pergunta mais estudos seriam necessários, mas temos aqui um forte indicativo de que, se não a única responsável, a intimina tem papel fundamental nos resultados aqui descritos.
Conclusões
A formação do padrão AL6 em uma amostra de aEPEC selecionada é resultante, na realidade, de um processo de internalização mediado principalmente pela expressão de intimina.
O fato de que uma mutação não-polar, no gene eae de uma amostra de aEPEC analisada neste estudo (1551-2), não aboliu por completo a adesão dessa amostra às células HeLa, reforça a idéia de que novas adesinas devem contribuir para a patogênese de amostras de aEPEC isoladas em nosso meio.
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