SEQUENCIAMENTO DIRETO DO GENE WNT1

Foram sequenciados os quatro exons do referido gene em cinco pacientes que não apresentavam mutações previamente identificadas nos genes analisados. Não foi encontrada nenhuma alteração nas regiões avaliadas. Contudo, o sequenciamento da porção dos exon 3 e 4a, foi inconclusivo em dois pacientes e será repetido posteriormente para fins de publicação dos resultados.

6 – DISCUSSÃO

A Osteogênese Imperfeita é uma doença caracterizada por fraturas recorrentes que apresenta ampla heterogeneidade genética. No presente trabalho foram analisados os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, SP7, SERPINF1, FKBP10 e WNT1 de 22 pacientes não consanguíneos que apresentavam diagnóstico clínico de Osteogênese Imperfeita. Foram identificadas mutações em 20% da amostra (5/22). As mutações detectadas estavam localizadas nos genes LEPRE1 e FKBP10.

Foram confirmadas as mutações missense c.1087 a>g (p.lys363glu) e c.2024 g>t (p. trp675leu) em heterozigose no gene LEPRE1 em dois casos (P.5 e P.15). Estes pacientes apresentam OI tipo III (forma grave), com características clínicas diversificadas como múltiplas fraturas ao logo da vida, deformidade óssea e deambulação comprometida. De acordo com a literatura mutações neste gene estão relacionadas com casos graves ou letais de Osteogênese Imperfeita (WILLAET et al., 2009; Wayne et al., 2007; WEIZHONG et al., 2009; MARINI et al., 2009). Enquanto o paciente P.5 é um caso isolado, o paciente P.15 possui outros familiares portadores da doença. Os pais de P.15 não são afetados, contudo, dois dos seus três irmãos apresentam sintomas de Osteogênese Imperfeita. Os pais de P.15 relataram um caso de aborto. De acordo com a classificação atual, indivíduos portadores de mutações no gene LEPRE1 são classificados como OI tipo VIII e apresentam sintomas graves ou letais de OI (FRATZL-ZELMAN et al., 2015).

Como o gene LEPRE1 esta relacionado com padrão de herança autossômico recessivo em OI, é preciso que existam duas mutações ao logo de sua sequência. Foram identificadas apenas uma das mutações nas amostras de DNA dos pacientes P.5 e P.15, possivelmente um caso de heterozigose composta. No presente trabalho foi realizado sequenciamento direto (metodologia de Sanger) de todas as porções codificantes do gene. Também foi realizado sequenciamento por NGS, método que fornece sequenciamento com relevante cobertura da porção codificante do gene. Contudo, mesmo após todos estes esforços não foi encontrada nenhuma outra alteração do gene LEPRE1 nos dois pacientes.

Os resultados de sequenciamento obtidos nesta pesquisa sugerem que a técnica de triagem de mutações por SSCP apresentou sensibilidade para o gene estudado. Assim, a escolha da metodologia de SSCP para estudo do gene LEPRE1 possui confiabilidade para análise de mutações.

A segunda alteração genética destes pacientes, ainda não identificada, pode estar localizada em regiões que englobam variação no número de cópias (Copy Number Variant-CNV) as quais não são detectadas pelas técnicas utilizadas neste trabalho. Outra hipótese que explicaria o fato de não termos detectado a segunda mutação destes pacientes se baseia na localização da mutação. A segunda mutação pode estar localizada em porções não codificantes do gene estudado, como regiões reguladoras intrônicas ou regiões promotoras do gene. Estas regiões não foram analisadas na pesquisa em questão.

Não detectamos mutações patogênicas nestes dois pacientes para os genes CRTAP, PPIB, SP7, SERPINH1, FKBP10, por NGS e no gene WNT1 após análise do sequenciamento de Sanger. Assim, existe relevante possibilidade destas mutações no gene LEPRE1 serem patogênicas e a segunda mutação não ter sido detectada nos estudos realizados. Contudo, como a segunda mutação não foi identificada nos dois casos, não podemos excluir a possibilidade destas alterações serem variantes genéticas raras não patogênicas, casos de dominância para o gene LEPRE1.

Foram identificadas mutações no gene FKBP10 em três pacientes não consanguíneos da amostra. Os pacientes P.7 e P.13 são portadores em homozigose de duplicações distintas no gene FKBP10: c.831dupC (exon 5) e c.21dupC (exon 1), respectivamente. Estas alterações estão descritas na literatura (http://www.le.ac.uk/ge/collagen).

Foram identificadas duas mutações em heterozigose composta no gene FKBP10 no paciente P.10, a mutação missense c.A179C (exon 1) e a mutação de sítio de splicing c.1063+2T>C (intron 6). Nenhuma das duas alterações foram previamente descritas na literatura (http://www.le.ac.uk/ge/collagen).

Os pacientes P.7, P.10 E P.13 apresentam sintomas de OI com gravidade moderada. Mutações no gene FKBP10 foram descritos em pacientes com Quadro clínico leve

com progressivo agravamento da doença (ALANAY et al., 2010; BARNES et al., 2012; STEINLEIN et al., 2011; VENTURI et al., 2012). Neste trabalho os pacientes portadores de mutações em FKBP10 apresentam características de gravidade moderada, como deformidade óssea, deambulação comprometida e número variado de fraturas após o nascimento, como nos pacientes descritos na literatura (VENTURI et al., 2012).

De acordo com a classificação atual, que se baseia no gene mutado, pacientes portadores de mutações no gene FKBP10 são classificados como OI tipo XI e apresentam deformidades de moderada a graves (BARNES et al., 2012). Além disto, os pacientes deste tipo de OI podem apresentar contraturas congênitas, característica também observadas na Síndrome de Bruck, doença que possui características semelhantes as da OI.

Não foram identificadas mutações patogênicas nos genes PPIB, CRTAP, SERPINH1, SP7 e WNT1.

Com base nos resultados encontrados, podemos destacar que os genes com maior probabilidade de identificarmos alterações na população estudada são os genes LEPRE1 e FKBP10 e que mutações nos genes PPIB, CRTAP, SERPINH1, SP7 e WNT1 são raras e não contribuem com as formas dominantes e recessivas na população do Espírito Santo.

A caracterização do padrão de mutações dos genes associados com Osteogênese Imperfeita em populações distintas pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias de diagnóstico molecular da doença, contribuindo para melhorar o aconselhamento genético das famílias e prevenir novos casos na população.

7 – CONCLUSÃO

A análise de sete genes (LEPRE1, FKBP10, PPIB, CRTAP, SP7, SERPINH1 e WNT1) associados à possível herança autossômica recessiva de pacientes com OI do Espírito Santo identificou mutações em 15% (5/22) da amostra. Mutações no gene LEPRE1 foram observadas em dois pacientes e no gene FKBP10 foram observadas mutações em três pacientes da amostra. Não foram identificadas mutações patogênicas nos genes PPIB, CRTAP, SP7, SERPINF1 e WNT1. Os resultados desta pesquisa sugerem que a maioria das variantes genéticas patogênicas encontradas em pacientes com OI de padrão autossômico recessivo do ES estão localizadas nos genes LEPRE1 e FKBP10. A caracterização do padrão de mutações em genes relacionados com OI em populações distintas podem melhorar nossos conhecimentos sobre a distribuição de mutações em OI e auxiliar no desenvolvimento de estratégias moleculares para o diagnóstico genético da doença.

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