4.3 METODOLOGIA
4.3.5 SEQUENCIAMENTO DO DNA GENÔMICO
Para a preparação do molde de sequenciamento, os primers da PCR-AE não foram marcados com nenhum corante fluorescente. Os produtos amplificados foram tratados com ExoSap (Biosciences®) para remover restos da reação. Em seguida, 1 uL de cada amostra foi novamente amplificada com os primers de sequenciamento (Applied Biosystems®).
As reações para sequenciamento foram purificadas usando o sistema
CleanSeq (Bioscience®) e, em seguida, foram sequenciadas por eletroforese capilar
ABI300.
As mutações foram investigadas por comparação com a sequência normal do gene JAK2 (NM- 004972) e um controle interno normal foram incluídos em cada reação.
5 RESULTADOS
Todos os pacientes participantes do projeto atenderam a um critério maior e um critério menor, de acordo com os Critérios de Diagnóstico de PV organizados pela Organização Mundial de Saúde, 2008. Um critério de grande importância para o diagnóstico é a detecção da presença da mutação no gene JAK2. A utilização de sangue periférico possui sensibilidade e especificidade similar ao aspirado de medula óssea para a detecção da JAK2 V617F (TAKAHASHI et al, 2013).
O quadro 3 mostra algumas características clínico-hematológicas apresentadas por cada paciente no momento do diagnóstico de PV e o resultado para a presença da mutação JAK2 V617F. Destacamos a presença de três pacientes com idades inferiores (27, 48 e 45 anos) à faixa etária de prevalência da doença. Ao que tudo indica tais pacientes não apresentaram nenhuma alteração clínica em relação aos demais pacientes que foram diagnosticados mais tardiamente.
Dos 31 pacientes atendidos no Hospital Universitário/UFJF e Hospital ASCOMCER, apenas 26 pacientes aceitaram participar da pesquisa, tendo idade média de 48 anos, faixa etária entre 27 e 88 anos, sendo dez do sexo masculino e dezesseis do sexo feminino.
QUADRO 3: Dados clínico-hematológicos apresentados pelos pacientes.
Fonte: A autora, 2014.
PACIENTES IDADE SEXO EVENTO TROMBÓTICO HEMATÓCRITO % HEMOGLOBINA g/dL LEUCOMETRIA PLAQUETAS ESPLENOMEGALIA JAK2 V617F
C.A.P 63 F NÃO 68 20 11.600 481.000 NÃO SIM
M.J.D.J 27 M NÃO 58 18,1 10.100 720.000 SIM SIM
R.A.B 77 M NÃO 60 18,1 86.000 490.000 NÃO SIM
R.M 68 M NÃO 50 17,2 8.200 416.000 NÃO SIM
M.P.A 82 F NÃO 39 13 6.200 280.000 NÃO SIM
T.G 66 F NÃO 58 19 12.000 450.000 SIM SIM
F.L.C.T 59 M NÃO 55,9 19,4 16.200 356.000 SIM SIM
J.C.A 41 M NÃO 61 19,5 7.300 220.000 NÃO SIM
J.S 48 M NÃO 56 18,1 26.100 783.000 NÃO SIM
M.C.L.S 71 F NÃO 71,6 21,5 14.600 696.000 SIM SIM
L.A.S 69 F NÃO 59,1 19 12.000 541.000 NÃO SIM
M.G.E 67 F NÃO 68,4 22,1 12.800 841.000 NÃO SIM
J.M.S 75 M NÃO 37 11,7 5.200 360.000 NÃO SIM
A.A.B 88 F SIM 57 18,2 15.400 1.147.000 NÃO SIM
F.B.F 55 M SIM 58 19 6.500 480.000 SIM SIM
E.S.N.S 63 F SIM 47,2 15,2 7.200 253.000 SIM SIM
T.S.M 74 F NÃO 63,2 20,3 11.200 390.000 NÃO SIM
R.M.A.A 62 F SIM 57 18,7 16.500 473.000 SIM SIM
M.D.L 78 F SIM 54,7 17,6 6.900 744.000 NÃO SIM
M.R.S.S 64 F NÃO 57,9 18,6 10.100 651.000 SIM SIM
A.R 72 M NÃO 51,9 18,2 13.000 810.000 NÃO SIM
I.T.S 54 F NÃO 60 18,5 14.500 788.000 NÃO SIM
M.H.G.A 57 F NÃO 54 16,9 13.300 1.093.000 NÃO SIM
A.S.E 58 M SIM 62,3 21,3 10.000 496.000 NÃO SIM
G.M.M.P 59 F NÃO 55,1 18 9.300 366.000 SIM NÃO
Inicialmente, utilizamos duas técnicas moleculares capazes de identificar a presença de mutações JAK2 V617F. A digestão enzimática com Bsa XI foi realizada em 19 pacientes e posteriormente realizamos o diagnóstico utilizando a técnica de PCR-AE. Os resultados de ambas as técnicas foram avaliados e percebemos que, além da PCR-AE ser uma técnica fácil e de menor custo, os resultados são mais eficientes e seguros dos que os apresentados pela primeira técnica. Assim sendo, adotamos a técnica de PCR-AE como rotina.
Das 26 amostras coletadas, 24 (92,3%) foram positivas para a mutação p.V617F (Figura 8), apresentando dois fragmentos na altura de 364 e 203 pares de base (pb), indicando os alelos tipo selvagem e mutado, respectivamente.
FIGURA 8: Gel de agarose 2%. Genotipagem para JAK2 V617F de algumas das amostras positivas (Linhas 2- controle negativo, com apenas a banda de 364 pb e linhas 3 a 11- amostras positivas). Linha M (Marcador de peso molecular, 1 Kb DNA Ladder, Promega®).
Do total de amostras, duas (7,7%) foram negativas, aparecendo apenas uma banda na altura de 364 pb (Figura 9). A partir desse resultado, realizamos o sequenciamento automático para verificar a presença de outras mutações que poderiam estar presentes no éxon 12 do gene. O sequenciamento de ambas as amostras não revelou alteração na sequência de nucleotídeos para o éxon 12 do gene JAK2 (dados não mostrados). Esses pacientes, diagnosticados como negativos para mutações no gene JAK2, não apresentaram sinais clínicos diferenciados em relação aos pacientes positivos para mutações no gene JAK2 e também não apresentaram histórico de eventos trombóticos.
FIGURA 9: Gel de agarose 2%. Genotipagem para JAK2 V617F. (Linhas 2- controle positivo, apresentando as bandas de 203 pb e 364 pb e linhas 3 e 4- amostras negativas, com apenas a banda de 364 pb). Linha M (Marcador de peso molecular, 1 Kb DNA Ladder, Promega®).
Durante o estudo com os 26 pacientes encaminhados para o setor de aconselhamento genético, foi investigado a presença de PV familial. Nenhum caso foi encontrado. No entanto, duas famílias nos chamaram a atenção devido à presença de algumas doenças hematológicas aparentemente segregando entre os familiares (Figuras 10 e 11), sendo descritas a seguir.
O paciente F.L.C.T (Registro PV10), sexo masculino, 59 anos, foi atendido no ambulatório do Hospital ASCOMCER/ Juiz de Fora, relatando pletora de mãos com sudorese, eritromelalgia e constatação de poliglobulia. O hemograma mostrava concentração de hemoglobina de 19,4 g/dL, hematócrito 56%, leucometria global de 16.200/mm3 e plaquetas a 350.600/mm³. Esses índices estavam acima dos valores de referência para a normalidade Apresentava esplenomegalia a 14,6 cm do rebordo costal esquerdo e biópsia de medula óssea com hipercelularidade das três séries medulares, principalmente eritroides e megacariócitos sugerindo Policitemia Vera. O paciente foi encaminhado ao serviço de aconselhamento genético da Universidade Federal de Juiz de Fora para avaliação molecular quanto à presença de mutações no gene JAK2.
FIGURA 10: Heredograma da família do paciente F.L.C.T.
O outro caso foi de T.G (Registro PV08), 66 anos, atendida no mesmo ambulatório, que procurou os serviços hematológicos sete meses após ter realizado uma histerectomia e apresentar um quadro clínico de hipercoagulabilidade. Ao fazer um hemograma apresentou índices elevados para hemoglobina (19 g/dL), hematócrito (58%), leucometria global (12.000/mm³) e plaquetas (571.200/mm³), além de esplenomegalia a 16 cm e biópsia de medula óssea compatível para doença mieloproliferativa.
Segundo relatos da paciente, haveria um caso de leucemia na família. Realizamos um aconselhamento genético para verificar a ocorrência de outras doenças hematológicas (Figura 11). No entanto, esse caso nos chamou a atenção para o quadro de hipercoagulabilidade apresentado pela paciente, destacando a presença de históricos de trombose e possíveis recorrências em muitos casos de NMPs.
FIGURA 11: Heredograma da família da paciente T.G.
Além da presença da mutação p.V617F, foi constatada a presença de eventos trombóticos em 25% (6/24) dos pacientes JAK2 positivos. A tabela 2 mostra a relação dos dados clínicos de cada paciente em relação ao número de eventos trombóticos e as mutações no gene JAK2.
TABELA 2: Relação de dados clínicos observados em relação a eventos trombóticos e as mutações em JAK2.
Fonte: A autora, 2014.
Todos os pacientes Média Hmt Média Hg Nº Pacientes com Nº Pacientes com Nº % % % Plaquetas > 450 000 mm³ Leucócitos > 10 000 mm³ Homens 10 37,03 55,01 18,06 6/10 5/10
Mulheres 16 62,96 54,83 18,13 12/16 11/16 Pacientes com Histórico de Trombose Média Hmt Média Hg Nº Pacientes com Nº Pacientes com
Nº % % % Plaquetas > 450 000 mm³ Leucócitos > 10 000 mm³ Trombose 6 25 56,98 18,12 5/6 3/6
Pacientes com Mutação JAK2V617F
Nº % Positivo 24 92,3 Negativo 2 7,7 Tratamentos utilizados (n=26) Nº Hidroxiuréia 26 Anticoagulantes 7* Sangrias 15 Esplenomegalia 9
6 DISCUSSÃO
A investigação de mutações no gene JAK2 em pacientes clinicamente diagnosticados com PV é de extrema importância para o diagnóstico molecular desses pacientes.
A positividade para a mutação JAK2 V617F foi de 92,3%, sendo que dois dos 26 pacientes (7,7%) foram negativos para mutações no gene JAK2. A porcentagem de detecção da mutação está de acordo com dados apresentados na literatura científica que é de aproximadamente 95-98% para os casos p.V617F positivos (GÄBER et al., 2013). A análise de outras possíveis mutações no gene
JAK2 foi investigada, não sendo detectada qualquer alteração. No entanto, não
podemos descartar o diagnóstico clínico de PV, que deve ser feito com cautela, pois é necessário levar em consideração demais genes que podem estar envolvidos na manifestação da doença (TEFFERI, 2010; FREITAS, SANTOS e MARANDUBA, 2013), embora a OMS faça citação apenas ao JAK2, e que outras doenças NMPs devem ser consideradas (SILVER et al., 2013). A ausência de mutações JAK2 V617F e no gene JAK2 de modo geral, são frequentemente baixas (GÄBER et al., 2013). No entanto, neste estudo, obtivemos uma frequência maior para a ausência dessas mutações do que é relatado na literatura científica.
Inicialmente, a técnica de digestão enzimática por Bsa XI foi empregada somente nas primeiras amostras de sangue periférico, pois esta técnica é considerada menos sensível ao diagnóstico de PV por apresentar alguns resultados falso-negativos. A digestão incompleta de amplicons podem potencialmente gerar resultados desse tipo, fragilizando o método de detecção (FRANTZ et al., 2007). Nos indivíduos comprometidos pela doença, a mutação p.V617F anula o sítio de ação da enzima, fazendo com que sejam observados apenas um fragmento na eletroforese.
Sendo assim, realizamos posteriormente apenas a PCR-AE. Esta técnica foi desenvolvida por Baxter et al. (2005) como uma ferramenta molecular para a detecção de mutações JAK2 V617F em pacientes com NMPs BCR-ABL negativas, onde os alelos tipo mutados são amplificados com primers específicos que possuem um mismatch na porção 3` do iniciador permitindo a amplificação apenas do alelo mutante. Há ainda outro iniciador, para controle interno da reação, que permite a amplificação de ambos os alelos. O primer reverse é comum aos primers forward
(BAXTER et al., 2005; TAN, WESTERMAN e DOBROVIC, 2007; PAGLIARINI e SILVA, 2013).
Com os dados aqui apresentados e os demais estudos citados, observamos que a frequência de casos de pacientes com PV em um único centro de atendimento na cidade de Juiz de Fora se encontram na faixa de prevalência da literatura para o éxon 14 (~ 95%) (HA et al., 2012; KILADJIAN, 2012). Além da presença da mutação p.V617F foi constatada a presença de eventos trombóticos em 25% (6/24) dos pacientes JAK2 positivos.
Entre as principais complicações da PV estão os eventos tromboembólicos, sendo causa de morbi-mortalidade nesses pacientes. Além das características clínico-laboratoriais, tais como, idade, histórico prévio de eventos trombóticos, obesidade, hipertensão, hiperlipidemia, aumento na contagem de células sanguíneas e alterações na composição dessas células, fazem com que ocorra uma mudança para o fenótipo pró-trombótico, facilitando os eventos trombóticos (VIANELLO et al., 2011).
As mudanças no estado pró-trombótico englobam tanto a expressão de fatores pró-coagulantes (micropartículas plaquetárias) e a ativação de propriedades proteolíticas, a secreção de citocinas e a expressão de moléculas de adesão. Há também uma resistência à proteína de ativação C, responsável por inativar alguns fatores de coagulação já ativados. Tais características pró-trombóticas irão modificar o endotélio vascular em resposta ao processo inflamatório das citocinas, a hiperviscosidade e a presença de proteases derivadas de leucócitos, tais como, a elastase, a catepsina G e a mieloperoxidase.
Dessa forma, um aumento nas moléculas de adesão do endotélio favorece o acúmulo de agregados de plaquetas, eritrócitos e leucócitos na parede vascular ajudando na deposição de fibrina e contribuindo para a ativação da cascata de coagulação (BARBUI, FINAZZI e FALANGA, 2013).
Mesmo na ausência de manifestações trombóticas, os pacientes com NMPs apresentam um estado de hipercoagulabilidade que pode ser identificado por um aumento na concentração de vários marcadores plasmáticos do sistema de ativação hemostático (VIANELLO et al., 2011). No mais, estudos sugerem que esses pacientes com NMPs que possuem a mutação JAK2 V617F tem um risco maior para tais complicações trombóticas, possivelmente devido ao aumento plaquetário e
ativação dos leucócitos (XAVIER et al., 2008).
O risco trombótico em pacientes com PV é mais proeminente em pacientes com idade próxima aos 60 anos e naqueles com histórico de trombose, podendo ser incluídos na categoria de alto risco. Porém, os riscos recorrentes nessa categoria não são homogêneos, não representando uma tendência previsível (STEFANO et
al., 2007; SEKHAR et al., 2013).
Com todo o exposto, é pertinente ressaltar que o estado trombofílico adquirido em PV é multifacetado e complexo, não sendo possível reduzir a explicação de ocorrências de tromboses a apenas uma via, já que vários fatores contribuem para a ocorrência da mesma.
Trabalhos apontam a prevalência de pacientes com PV em associação com a ocorrência de eventos trombóticos. Rugerri et al. (2003) estudaram uma população de uma cidade no norte da Itália, onde a prevalência de PV é de 30 casos/100.000 habitantes. Destes, 10-20% (seis pacientes) podem ter complicações trombóticas. Marchioli et al. (2005) realizaram um estudo em 12 países europeus, sendo que dos 1.638 pacientes com PV, 38,6% (633 pacientes) tiveram histórico de trombose.
Com isso, salientamos a importância da investigação das causas de eventos trombóticos que acometem os pacientes, principalmente as de origem venosa com origem incomum, ressaltando para a investigação de doenças NMPs, uma vez que há alta ocorrência de casos trombóticos registrados em pacientes com essas neoplasias, além do risco de recorrência se não forem utilizados anticoagulantes ou antiplaquetários no tratamento desses pacientes, principalmente naqueles com idade próxima aos 60 anos. O objetivo da terapia é reduzir os riscos de trombose e hemorragias. Em particular, baixas doses de ácido acetilsalicílico (81-100 mg/dia) ou em combinação com flebotomias e/ou hidroxiuréia representam um componente consistente para o tratamento, independente da estratificação de risco (PATRONO
et al., 2013).
O tratamento da PV em pacientes p.V617F positivos ainda não é diretamente associado ao uso de inibidores da via JAK-STAT. No entanto, as células que expressam JAK2 V617F parecem ser mais sensíveis aos inibidores JAK2 do que as células que não possuem essa mutação (FRIEDMAN et al., 2007).
7 CONCLUSÕES
Os Hospitais HU/UFJF e ASCOMCER de Juiz de Fora, Minas Gerais, recebem vários pacientes, da cidade e região, encaminhados para o diagnóstico e tratamento de várias doenças, entre elas as neoplasias mieloproliferativas. A frequência encontrada neste estudo para a PV (92,3%) é coerente com dados apresentados na literatura (cerca de 95%). Ainda, chamamos a atenção para a correlação genótipo-fenótipo na porcentagem de eventos trombóticos de origem venosa ocorridos nos pacientes (25%) e salientamos a importância de se investigar esses eventos em associação a alguma NMP.
A importância da investigação da mutação JAK2 V617F na prática do diagnóstico de PV e a relevância do diagnóstico para a presença da mutação, nos casos JAK2 V617F negativos, ainda precisam ser melhor investigados, principalmente em relação às demais vias de sinalização envolvida com a ativação da via JAK-STAT.
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