Sequenciamento em larga escala Plataforma 454 FLX Roche

O final do século 20 foi marcado por uma revolução no domínio da biologia molecular graças à inovação das técnicas de sequenciamento. No início da década de 70, foram desenvolvidas as primeiras tecnologias de sequenciamento por Maxam & Gilbert, que tinham como base o uso de substâncias químicas promovendo o rompimento da molécula de DNA em nucleotídeos específicos. Em 1977, Sanger propôs o sequenciamento chamado de ‘método dos didesoxinucleotídeos’ (KREUZER; MASSEY, 1996). A técnica de sequenciamento de Sanger é baseada na síntese de uma nova molécula de DNA com a incorporação de nucleotídeos comuns (desoxinucleotídeos - dNTPs) e didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Quando os ddNTPs são aleatoriamente incorporados, não há mais extensão do fragmento. Portanto, as moléculas de ddNTPs são terminadores de

cadeia que eram, inicialmente, marcados radioativamente. Hoje em dia, são marcados por fluoróforos. O método de Sanger foi automatizado na segunda metade da década de 80, o que aumentou incrivelmente as possibilidades de pesquisas genéticas via sequenciamento de DNA, continuou a ser aprimorado e é amplamente utilizado até hoje. No entanto, com a intenção de atender outras demandas (como em medicina diagnóstica e preventiva, estudos de biodiversidade, sequenciamento de genomas completos, etc), ganhar tempo no preparo de amostras e diminuir custos, outras tecnologias de sequenciamento, denominadas de tecnologias de sequenciamento de nova geração, começaram a ser comercializadas a partir de 2005 e estão evoluindo rapidamente. Todas essas tecnologias promovem o sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. O sistema 454 FLX da Roche, também chamado de pirosequenciador, foi a primeira plataforma de sequenciamento de nova geração a ser comercializada e ainda há ampla utilização desta técnica em todo o mundo.

Pirosequenciamento é um método de síntese enzimática que, a grosso modo, pode ser dividido em três etapas: (a) preparo da amostra, (b) PCR em emulsão e (c) sequenciamento Figura 2. Na etapa (a) o DNA é fragmentado aleatoriamente e ligado a adaptadores A e B em suas extremidades. Os fragmentos A/B são selecionados para o sequenciamento. Na etapa (b) os fragmentos são ligados a microesferas magnéticas por meio do pareamento com sequências curtas complementares presentes na superfície das microesferas. Apenas um único tipo de fragmento se liga a uma determinada microesfera. As microesferas são capturadas individualmente em gotículas oleosas onde a PCR em emulsão ocorre. Milhares de cópias do fragmento alvo são produzidas nessa fase. As microesferas ligadas às sequências alvo de fita simples são capturadas individualmente em poços no suporte de sequenciamento. A seguir, na etapa (c), as reações de sequenciamento ocorrerão em cada poço, para um único tipo de fragmento ligado à microesfera, não havendo, portanto, competição por reagentes com outros fragmentos da biblioteca. Nesta etapa, são fornecidos os reagentes para a reação de pirosequenciamento, baseado na detecção do pirofosfato (PPi) durante a síntese de uma molécula de DNA. As quatro enzimas incluídas no sistema de pirosequenciamento são:

fragmento Klenow da DNA polimerase I, ATP sulfurilase, luciferase e apirase. A reação depende também de três substratos enzimáticos: adenosina fosfossulfato (APS), d-luciferina e um molde de DNA contendo um iniciador, que serve como material de partida para a DNA polimerase I. Os quatro nucleotídeos vão sendo adicionados um de cada vez, de forma cíclica. Todas as vezes que um nucleotídeo é incorporado pela DNA polimerase I, ocorre liberação de uma molécula de pirofosfato, então se inicia uma cascata enzimática que é finalizada quando a d- luciferina, pela ação da luciferase, é convertida em oxiluciferina. Neste momento há a emissão de um sinal de luz. O sinal de luz emitido é identificado a cada base incorporada, em cada poço de sequenciamento, sendo captado por uma câmera CCD (charge-coupled device) acoplada ao sistema. O sinal florescente gerado é proporcional à quantidade de nucleotídeos que são incorporados (AHMADIAN; EHN; HOBER, 2006, DELFORNO, 2014 e CARVALHO; SILVA, 2010).

Figura 2: Ilustração das etapas do sequenciamento em larga escala na Plataforma 454 Roche.

Fonte: Mardis, 2008. Trends in Genetics.

Em comparação às demais tecnologias de sequenciamento de segunda geração, a plataforma 454 é uma das que produz as maiores leituras (300 - 800 pb) e por isso tem sido utilizada, inclusive, para o sequenciamento de genomas de

bactérias, vírus e até de alguns eucariotos (WICKER et al., 2008). Pelo fato de não envolver clonagem bacteriana, a representação do genoma é bem mais fiel, de forma que sequências difíceis de clonar podem ser acessadas (CARVALHO; SILVA, 2010).

O pirosequencimento é um bom recurso para estudo da diversidade genética, seja por metagenômica ou por pool de amplicons do gene RNAr 16S. Neste estudo, a metodologia utilizada foi via pool de amplicons do gene RNAr 16S. A escolha de primers para esta finalidade segue o mesmo princípio do sequenciamento das regiões do gene RNAr 16S via método de Sanger.

Um grande número de trabalhos relata o bom desempenho da técnica de pirosequenciamento para caracterização da microbiota de lodos ativados relacionados ao tratamento de efluentes de origens diversas, utilizando-se amplicons do gene rRNA 16S. Em Lee; Kang & Park (2015), comunidades bacterianas constituintes de lodo ativado presente em um biorreator para tratamento de efluentes provenientes de esgoto doméstico, foram identificadas, via pirosequenciamento, em quatro diferentes plantas e períodos para posterior comparação. Os resultados evidenciaram uma comunidade altamente complexa, com grande diversidade foi possível concluir sobre a diferença de composição e dinâmica entre as amostras de lodo ativado que foram comparadas. Em outro estudo, o pirosequenciamento do gene RNAr 16S foi aplicado a fim de proporcionar uma melhor compreensão sobre a estabilidade da diversidade microbiana total presente em lodo ativado, quando este era submetido a diferentes parâmetros ambientais e operacionais (BAGCHI et al., 2015). Em um interessante estudo comparativo entre arqueias (AOA) e bactérias amônia oxidativas presentes em lodo ativado utilizado em tratamento de efluentes domésticos, o pirosequenciamento do gene RNAr 16S foi realizado para arqueias e bactérias com o intuito de avaliar quais eram os micro-organismos presentes que estavam relacionados à nitrificação (DING et al., 2015).