5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.5. Simulação das condições gastrointestinais in vitro
A viabilidade do L. casei após exposição às condições gastrointestinais simuladas estão expostas na Tabela 10. Quando as amostras foram submetidas ao SGS, verificou-se uma boa estabilidade das células microencapsuladas, com redução média de 1,42 Log UFC/mL (14,6%) após 2 horas. Em contrapartida, as bebidas contendo células livres apresentaram perda total da viabilidade após 120 minutos de exposição ao SGS. Da mesma forma, quando as condições intestinais foram simuladas, o L. casei aprisionado mostrou-se mais resistente, com redução de <1 Log UFC/mL durante todo período de exposição, em comparação às células livres com diminuição média de 5,69 Log UFC/mL (62,1%).
A microencapsulação influenciou beneficamente na sobrevivência do probiótico em condições gastrointestinais simuladas in vitro, o que está de acordo com relatos anteriores da literatura (DE PRISCO et al., 2015; CAI et al., 2014; ZOU et al., 2011; CHAIKHAM et al., 2012). Utilizando a mesma metodologia de simulação gastrointestinal, García-Ceja et al., (2015) observou que a viabilidade de Lactobacillus acidophillus e reuteri, encapsulados por extrusão, reduziu cerca de 1 Log UFC após simulação gástrica por 120 minutos. Em relação a exposição ao suco intestinal simulado, observaram queda de aproximadamente 2,5 Log UFC após 2 horas, exibindo menor resistência que as observadas por este estudo. De Prisco et al.,
9,94 a B 9,89 a A 10,18 a A 9,82 b A 10,17 a A 9,91 b A 10,23 a A 9,85 b A 10,20 a A 8,15 b B 0 2 3 5 6 8 9 11 0 7 14 21 28 MÉ DIA L O G ( UF C/ML )
(2015) relatam que não observaram nenhuma redução expressiva na viabilidade de L. reuteri, encapsulados com alginato-quitosana, quando submetidos a simulações gástrica (pH 2,5; pepsina) e intestinal (Sais biliares). Pode-se concluir que capsulas de alginato revestidas de quitosana mantém elevada viabilidade quando submetidas as condições gastrointestinais in vitro.
Microesferas formadas com alginato de sódio e carbonato de cálcio, como as deste estudo, apresentam ótimas propriedades mecânicas e estrutura mais densa, diminuindo a porosidade (CAI et al., 2014). A quitosana, utilizada como polímero de revestimento, fornece uma proteção adicional ao material encapsulado, pois, por possuir carga positiva, forma um complexo insolúvel com o alginato, originando uma superfície semi-permeável (DE PRISCO et al., 2015; ZOU et al. 2011).Vale ressaltar também a teoria proposta por Nualkaekul et al. (2012), que observaram que o efeito protetor das cápsulas, frente as condições adversas de baixo pH, pode ser devido ao fato dos polissacarídeos (alginato/quitosana) atuarem como tampão, aumentando o pH no interior da matriz a um nível menos nocivo para as bactérias. Deste modo, pode-se justificar os resultados deste estudo quanto a elevada viabilidade de L. casei encapsulado em condições gastrointestinais simuladas.
No que diz respeito as células livres adicionadas em sucos de fruta, pesquisas têm demonstrado, utilizando diferentes cepas probióticas, perda total da viabilidade já na simulação gástrica (CHAIKHAM et al., 2012; ZOU et al, 2011; NUALKAEKUL et al., 2012; TRABELSI et al., 2013; CHÁVARRI et al., 2010). O efeito da simulação gastrointestinal in vitro foi estudado Chaikham et al. (2012) que verificaram que células livres adicionadas a longan (Nephelium longanum) juice foram completamente eliminadas durante simulações gástricas (pH 1,4) após 1,5 horas para L. acidophillus e 1 hora para L. casei, fato este observado neste estudo apesar de utilizar diferente metodologia de simulação gastrointestinal. Diante das evidências, no que se refere a baixa sobrevivência de células livres em condições ácidas, como as do estômago, pesquisas tem concluído que somente probióticos microencapsulados tem a capacidade de manter a viabilidade em condições gastrointestinais (CHÁVARRI et al., 2010; TRABELSI et al., 2013; IYER; KAILASAPATHY, 2005).
Vale ressaltar que, existe um considerável corpo de evidências que mostra que mesmo as células probióticas mortas são capazes de produzir efeitos benéficos a saúde, no que se refere ao estímulo a respostas anti-inflamatórias e na modulação do sistema imunológico (ADAMS,
2010; FANG et al., 2014; HABIL et al., 2014; KISO et al., 2013; SANG et al., 2015; ORLANDO et al., 2012).
Não foram observadas diferenças significantes na viabilidade, com relação ao tempo inicial e final de armazenamento durante exposição às condições gástricas e intestinais (Tabela 10). Pesquisas mostram que pH mais baixo durante o crescimento bacteriano induz uma maior tolerância a ambientes ácidos, a condições osmóticas e oxidativas (HARTKE et al., 1996; LORCA; FONT DE VALDEZ, 2001; VAN DE GUCHTE et al., 2002). Com base nesta hipótese, as células estocadas na bebida de caju ácida por 28 dias, podem ter adquirido um certo grau de adaptação ao ambiente hostil, justificando, portanto, o fato do armazenamento não ter sido um fator interferente na sobrevivência do L. casei durante as condições gastrointestinais simuladas.
Estudo realizado por Champagne e Gardner (2008), é o único que também comparou o tempo de estocagem e a resistência das células ás simulações gastrointestinais in vitro. Diferente dos resultados deste estudo, verificaram que a estocagem prévia por 35 dias a 4 ºC, em diferentes sucos de frutas, resultou numa maior perda da viabilidade, cerca de 1.2 log UFC, após exposição por 2 horas ao suco gástrico simulado (pH 2,0).
Tabela 10. Contagem de células viáveis (Média ± desvio padrão) e taxa de sobrevivência do L. casei microencapsulado (M) e Livre (L), no tempo inicial (dia zero - D0) e no período final de armazenamento (dia 28 – D28), durante exposição ao suco gástrico simulado (SGS) ou suco intestinal simulado (SIS).
Valores (médias ± desvio padrão) seguidos pela mesma letra minúscula na mesma linha não diferem ao nível de 5%. Valores (médias ± desvio padrão) acompanhados pela mesma letra maiúscula na mesma coluna não diferem ao nível de 5%, separadamente para SGJ e SIJ. Anova one way e teste de Tukey.
1Média ± desvio padrão para n = 2.
2Calculado pela divisão da população de células viáveis final pela inicial e multiplicado por 100 para obter o valor percentual.
3Não detectado (níveis abaixo de 102 UFC/mL).
Tempo de incubação (min)
M – D0 M – D28 L – D0 L – D28
Log UFC/mL1 Sobrevivência
(%)2 Log UFC/mL Sobrevivência (%) Log UFC/mL Sobrevivência (%) Log UFC/mL Sobrevivência (%) SGS 0 9,69 ± 0,23 a A 100% 9,96 ± 0,16 a A 100% 9,61 ± 0,06 a A 100% 8,92 ± 0,03 b A 100% 60 9,17 ± 0,26 a A 93,3% 9,25 ± 0,40 a A 98,5% 5,56 ± 0,03 b B 57,8% 2,58 ± 0,06 c B 29,1% 120 8,42 ± 0,12 a B 86,5% 8,38 ± 0,30 a B 84,3% ND3 ND ND ND SIS 0 9,79 ± 0,04 a A 100% 9,74 ± 0,14 a A 100% 9,62 ± 0,12 a A 100% 8,85 ± 0,10 b A 100% 60 9,59 ± 0,10 a A 97,5% 9,43 ± 0,39 a AB 96,8% 5,80 ± 0,16 b B 59,5% 5,28 ± 0,42 b B 60,6% 120 9,24 ± 0,04 a B 94,3% 9,16 ± 0,14 a B 94,0% 3,84 ± 0,10 b C 40,2% 3,25 ± 0,43 b C 34,9%