SIMULAÇÕES DE DOCKING MOLECULAR

Os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico foram desenvolvidos com o intuito de exercerem atividade de inibição da enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons Mg²+ presentes no sítio ativo, que funcionam como cofatores (PLEWE et al., 2009). Neste estudo foram avaliadas as interações entre os complexos ligante-proteína dos seguintes derivados: o mais ativo (1c), o segundo mais ativo (21c), um análogo estrutural do mais ativo (19a), o menos ativo (24a) e um inativo (18a).

Foi atribuída a RAL e aos ligantes estudados, exceto 18a, carga parcial -1 para o átomo de oxigênio da hidroxila da função ácido hidroxâmico, e para o átomo de oxigênio da hidroxila ligada ao anel pirimidinona no caso do RAL. RAL possui pka = 2,13, e os compostos possuem pka entre 8,2 e 8,6, logo há uma fração ionizada em pH = 7,2, no qual foi realizado o ensaio de atividade enzimática (PLEWE et al., 2009; CHEMICALIZE, 2014).

Não foram observadas interações de RAL e dos derivados azaindóis com os íons Mg²+ em simulações de docking realizadas com tais compostos não ionizados. Sabe-se que os dicetoácidos, primeiros compostos inibidores da HIV-IN descobertos, apresentam entre seus grupos farmacofóricos um carboxilato que pode ser substituído por um bioisóstero (ROGOLINO et al., 2012). De Luca e colaboradores (2011), consideraram a porção ácido

carboxílico como carboxilato em seus estudos de docking com dicetoácidos. Logo, há influência do estado de ionização na interação com os íons Mg²+, sendo fundamental a presença de hidrogênios ionizáveis em compostos inibidores da HIV-IN, como observado na Figura 34.

Figura 34: Estrutura geral dos dicetoácidos e estruturas químicas do RAL e do composto 1c, com destaque para os hidrogênios ionizáveis.

Para cada ligante foi gerado um grupo (cluster) com 15 soluções (poses). A melhor solução foi escolhida levando em consideração o menor valor possível de Re-Rank e sobreposição com RAL.

A função de pontuação Re-Rank foi utilizada porque a melhor solução obtida na validação do protocolo de docking foi a que apresentou menor valor de RMSD e melhor Re- Rank. O Re-Rank é uma função de pontuação que leva em conta um termo de torção sp2-sp2 e o potencial 12-6 de Lennard-Jones, que é utilizado para interações estéricas; para interações eletrostáticas é utilizado o potencial de Coulomb. Ele identifica a mais promissora solução das soluções obtidas pelo algoritmo de docking (MOLEGRO, 2011).

A Tabela 5 é um resumo das propriedades das melhores soluções escolhidas para cada composto e RAL.

Tabela 5: Valores de MolDock, Re-Rank e Einter das soluções escolhidas para cada composto e RAL.

Composto MolDock Score Re-Rank Score Einter (Kcal/mol)

RAL -210,93 -135,315 -218,286 1c -152,61 -97,70 -160,765 21c -183,58 -121,46 -184,873 19a -159,16 -100,43 -168,813 24a -187,86 -120,99 -203,29 18a -140,69 -92,6026 -164,528

Após a escolha da melhor solução obtida para cada composto, foi feita uma análise da conformação e do modo de interação de cada ligante com a enzima, em comparação com RAL, fármaco de referência.

O fármaco de referência RAL apresentou 10 interações do tipo ligação de hidrogênio: i) Asp185-OD1 e RAL-O5 (distância O---O = 2,83 Å); ii) Tyr212-OH e RAL-O1 (distância O---O = 2,19 Å); iii) Glu221-OE2 e RAL-O3 (distância O---O = 2,92 Å) iv) RAL-O4 e Asp128-OD1 (distância O---O = 3,13 Å) v) RAL-O4 e Asp128-OD2 (distância O---O = 3,01 Å) vi) RAL-O4 e Glu221-OE2 (distância O---O = 2,96 Å) vii) RAL-O4 e H2O456-O1 (distância O---O = 3,18 Å) viii) RAL-O4 e H2O534-O1 (distância O---O = 2,97 Å) ix) H2O401-O1 e RAL-O5 (distância O---O = 3,02 Å) x) H2O534-O1 e RAL-O5 (distância O---O = 2,51 Å). Na Figura 35, estão representadas essas interações.

Figura 35: Interações do tipo ligação de hidrogênio detectadas para RAL (amarelo).

Obs.: As duas esferas verdes representam os íons Mg²+ e as pequenas esferas vermelhas são moléculas de água.

Além das ligações de hidrogênio, foram detectadas interações do tipo eletrostáticas entre o oxigênio ionizado do RAL e os dois íons Mg²+, que funcionam como cofatores (distâncias O4---Mg1 = 2,031 Å e O4---Mg2 = 2,257 Å) (Figura 36). Essa interação é uma das mais importantes para a atividade antiviral, uma vez que a inibição enzimática dos fármacos dessa classe é caracterizada pela complexação com os dois íons Mg²+ presentes no sítio ativo (HAZUDA, 2012).

Figura 36: Interações eletrostáticas entre RAL (amarelo) e os íons Mg²+ (verde).

Ainda foram observadas quatro interações hidrofóbicas do tipo π-π para RAL (Figura 37): i) entre o anel oxadiazol e o anel imidazol da base nitrogenada adenina (distância = 4,62 Å) ii) entre o anel oxadiazol e o anel pirimidina da base nitrogenada adenina (distância = 4,30 Å) iii) entre o radical p-fluorofenil e a base nitrogenada citosina (distância = 3,64 Å) iv) entre o anel pirimidinona e o fenol de Tyr212 (distância = 3,65 Å).

Figura 37: Interações hidrofóbicas do tipo π-π detectadas para RAL (amarelo).

Foram observadas interações intermoleculares do tipo ligação de hidrogênio para os derivados azaindóis, como representado nas Figuras 38, 39, 40, 41 e 42.

Figura 38: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 1c nas simulações de docking molecular.

Figura 39: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 21c nas simulações de docking molecular.

Figura 40: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 19a nas simulações de docking molecular.

Figura 41: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 24a nas simulações de docking molecular.

Figura 42: Ligações de hidrogênio (linhas verdes tracejadas) realizadas pelo composto 18a nas simulações de docking molecular.

As distâncias das ligações de hidrogênio detectadas para os cinco derivados azaindóis avaliados estão listadas na Tabela 6.

Tabela 6: Distâncias das ligações de hidrogênio realizadas pelos derivados azaindóis nas simulações de docking molecular.

Ligação de hidrogênio Composto Participantes Distância

1c

1c-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,37 Å 1c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,02 Å

1c-O2 e DNA-N O---N = 3,10 Å 21c

21c-O2 e DNA-N2 O---N = 2,94 Å 21c-O2 e H2O534-O1 O---O = 3,12 Å 21c-O3 e Tyr212-O O---O = 1,73 Å 19a

19a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,60 Å 19a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,50 Å 19a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 3,08 Å 24a

24a-O1 e H2O534-O1 O---O = 2,68 Å 24a-O2 e H2O534-O1 O---O = 2,81 Å 24a-O2 e Asp185-OD1 O---O = 2,83 Å 18a 18a-N1 e H2O456-O1 O---N = 2,72 Å 18a-O2 e Asn213-N N---O = 2,21 Å

Interações do tipo sigma-π foram observadas apenas para o composto 1c, entre o radical p-fluorofenil e o resíduo Pro214 (distância = 2,48 Å). O composto 21c não apresentou interações do tipo π-π. Nas Figuras 43, 44, 45 e 46 estão as interações observadas para os demais compostos.

Figura 43: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 1c.

Figura 45: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 24a.

Figura 46: Interações do tipo π-π (linhas laranjas) detectadas para o composto 18a.

As distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π detectadas para os cinco derivados azaindóis avaliados estão listadas na Tabela 7.

Tabela 7: Distâncias das interações intermoleculares do tipo π-π realizadas pelos derivados azaindóis nas simulações de docking molecular.

Interação π-π

Composto Participantes Distância

1c

Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 4,82 Å Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,18 Å Radical p-fluorofenil e citosina 3,51 Å 21c Não apresentou interações do tipo π-π.

19a

Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 5,02 Å Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,19 Å Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,46 Å Radical p-fluorofenil e citosina 3,52 Å 24a

Azaindol (anel piridina) e adenina (anel pirimidina) 5,08 Å Azaindol (anel piridina) e adenina (anel imidazol) 4,29 Å Azaindol (anel pirrol) e adenina (anel imidazol) 5,55 Å Radical p-fluorofenil e citosina 3,52 Å

18a Radical p-fluorofenil e citosina 4,80 Å

O oxigênio ionizado (O2) dos compostos 1c, 21c, 19a e 24a realizou interação eletrostática com pelo menos um dos íons Mg²+ e resíduos da tríade catalítica. Essas interações estão representadas nas Figuras 47, 48, 49 e 50.

Figura 47: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto 1c.

Figura 48: Interações eletrostáticas e suas respectivas distâncias (em Å) detectadas para o composto 21c.

Figura 49: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto 19a.

Figura 50: Interação eletrostática e sua respectiva distância (em Å) detectada para o composto 24a.

De acordo com Plewe e colaboradores os derivados azaindóis do ácido hidroxâmico inibem a enzima HIV-IN através da complexação com os dois íons Mg²+ presentes no sítio ativo (PLEWE et al., 2009). Entre os compostos analisados, apenas 21c apresentou interação com ambos os íons. Foi observado que seu oxigênio ionizado (O2) encontra-se sobreposto ao do RAL, e posicionado entre os dois íons Mg²+ (Figura 48). Nos demais compostos esta sobreposição não foi detectada, inclusive no mais ativo, 1c, onde foi observada interação com apenas um íon Mg²+.

Na estrutura química do composto 18a não há oxigênios ionizáveis (Figura 51). Os radicais R1 e R2 são grupos metila. Logo, não houve interação com os íons Mg²+, o que explica sua ausência de atividade biológica. Além disso, encontra-se distante do DNA, realizando apenas uma interação do tipo π (distância = 4,80 Å), maior que a observada para os compostos 1c, 19a e 24a (distância = 3,51 Å, 3,52 Å e 3,52 Å, respectivamente).

Figura 51: Estrutura tridimensional do composto 18a.

Ao comparar a conformação dos compostos estudados com RAL, apenas 21c apresenta conformação diferente. Nos demais houve sobreposição com RAL, como pode ser observado nas Figuras 52, 53, 54, 55 e 56.

Figura 53: Sobreposição de 21c com RAL (amarelo).

Figura 55: Sobreposição de 24a com RAL (amarelo).

Figura 56: Sobreposição de 18a com RAL (amarelo).

Pode-se observar que 1c, 19a e 24a estão posicionados na cavidade de forma semelhante, com sobreposição entre os radicais p-fluorofenil do RAL e dos respectivos compostos. Isto fez com que houvesse interação de O2 com apenas um dos íons Mg2+. Em 21c, a presença de substituintes na posição R3 fez com que ele se posicionasse de modo diferente dos demais, permitindo que O2 interagisse com ambos os íons Mg²+, semelhante ao que ocorre com RAL.

O número de interações feitas por 21c e 1c pode explicar o fato de 21c ser ligeiramente menos ativo que 1c, apesar de sua interação com ambos os íons Mg²+. Foram detectadas três interações do tipo ligação de hidrogênio para ambos, mas 1c apresenta quatro interações do tipo π, e 21c nenhuma. A conformação adotada por 1c na cavidade permitiu uma melhor interação com a proteína-alvo, o que não ocorreu com 21c. É importante ressaltar que RAL realiza interações do tipo π-π com a proteína-alvo nos mesmos locais que 1c.

Foi observado que 19a e 24a apresentaram perfis de interação semelhantes. A flexibilidade do radical R2 parece dificultar a aproximação entre estes compostos e o DNA, pois as distâncias interatômicas das interações π são maiores que as observadas para o composto 1c. Ainda em relação às interações não foram observadas diferenças significativas devido à diferença de volume do radical R2 em 19a e 24a.