SISTEMAS DE CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS

Diferentes protocolos de cultivo de folículos pré-antrais têm sido descritos na literatura e, conforme mostrado na figura 5, o cultivo in vitro desses folículos pode ser realizado no interior do tecido ovariano, conhecido também como cultivo in situ, o qual pode ser realizado com o ovário inteiro (DEMEESTERE et al., 2005; ABIR et al., 2006) ou em pequenos fragmentos (3 x 3 mm com 1 ou 0.5 mm de espessura) de ovário (LIMA et al., 2013;

ESMAIELZADEH et al., 2013; GUEDES et al., 2017; SILVA et al., 2018). Além do cultivo in

situ, os folículos pré-antrais, predominantemente, os secundários podem ser cultivados isolados

ou fora do ambiente ovariano, que também pode variar, ou seja, podendo ser um cultivo bi ou tridimensional, conforme descrito abaixo. Na tentativa de obter melhores resultados, os folículos pré-antrais podem ser incialmente cultivados in situ por um período que pode variar de 6 a 8 dias e em seguida, os folículos maiores (111 ± 1.46 µm) podem ser isolados e cultivados por um período adicional que pode variar de 4 a 15 dias. Nesse caso, o sistema é conhecido como cultivo de dois ou multi passos (EPPIG; O´BRIEN, 1996; O´BRIEN et al., 2003; TELFER et al., 2008; MCLAUGHLIN; TELFER, 2010; MCLAUGHLIN; et al., 2018).

O cultivo in situ é considerado de extrema importância para o estudo da ativação de folículos primordiais e do posterior crescimento de folículos primários, em várias espécies, como caprinos (CELESTINO et al., 2009), bovinos (JIMENEZ et al., 2016), babuínos (WANDJI et al., 1997), equinos (AGUIAR et al., 2016) e humanos (ZHANG et al., 2004). Além da praticidade, o cultivo in situ apresenta também como vantagem a manutenção do contato celular (ABIR et al., 2006) e da integridade tridimensional dos folículos. No entanto, apesar do êxito já relatado, poucos folículos primários cultivados progridem até o estágio de folículo secundário (FORTUNE, 2003).

O cultivo de folículos isolados apresenta como vantagens a possibilidade do acompanhamento individual dos folículos durante o cultivo, além de oferecer também uma melhor perfusão do meio para cada folículo na placa de cultivo (ABIR et al., 2006). Outro aspecto favorável é que se caso o folículo sofra atresia durante o cultivo, as substâncias produzidas em decorrência desta morte, não afetarão outros folículos. O cultivo de folículos isolados pode ser bidimensional ou tridimensional.

No sistema bidimensional, o folículo é colocado diretamente sobre uma placa de cultivo (LUZ et al., 2012; SILVA et al., 2015; APOLLONI et al., 2015), ou sobre uma camada de células somáticas ou de matriz extracelular, como o alginato (VANACKER e AMORIM, 2017). Estudos em diferentes espécies revelaram que folículos secundários isolados são capazes de crescer e formar antro nesse tipo de cultivo (caprina: SARAIVA et al., 2010; ovina: ARUNAKUMARI et al., 2010; suína: WU; TIAN, 2007; bubalina: GUPTA et al., 2008).

No sistema tridimensional, os folículos, inicialmente são inseridos em uma matriz extracelular (colágeno: CARROLL et al., 1991; HIRAO et al., 1994; fibrina: BRITO et al., 2014; alginato: WEST et al., 2007; XU et al., 2009) ou até mesmo uma cobertura de alginato já aderida à placa de cultivo, como descrito, recentemente por XU et al. (2018) com a finalidade

de manter a morfologia original do folículo. Esse cuidado é fundamental para garantir a comunicação entre o oócito e as células somáticas que o circundam (SPEARS et al., 1994), via junções gap, pelas quais circulam fatores parácrinos essenciais que proporcionam crescimento e maturação do oócito (CARABATSOS et al., 2000). A perda desse contato causa a liberação de oócito atrésico (EPPIG et al., 2005). Alguns estudos mostraram que o co-cultivo com células da granulosa utilizando gel de colágeno em sistema tridimensional foi capaz de suportar o crescimento folicular em humanos (ABIR et al., 1999), suínos (HIRAO et al., 1994), murinos (OKTEM; OKTAY, 2007) e bovinos (ALM et al., 2006), possibilitando a manutenção da estrutura tridimensional do folículo até a fase antral. Embora os resultados com esse tipo de sistema tenham sido animadores, o único relato de nascimento obtido a partir de folículos pré- antrais desenvolvidos in vitro foi obtido utilizando o sistema de dois passos (EPPIG, O´BRIEN, 1996; O´BRIEN et al., 2003). A figura 6 representa os diferentes sistemas de cultivo de folículos ovarianos.

Figura 6 - Diferentes sistemas de cultivo de folículos ovarianos

Fonte: Elaborado pelo próprio autor.

Em 1996, os pesquisadores EPPIG e O'BRIEN publicaram a prova de que é possível obter nascimento a partir de folículos primordiais crescidos e desenvolvidos totalmente in vitro. Nesse estudo, os autores cultivaram incialmente folículos primordiais de camundongos, no

interior do ovário ou in situ (primeiro passo) durante um perído de oito dias. Posteriormente, os folículos secundários avançados foram isolados do tecido ovariano previamente cultivado e foram cultivados por um período adicional de 14 dias (segundo passo). Após o crescimento e desenvolvimento dos oócitos in vitro, os complexos oócito-células da granulosa foram maturados e fertilizados in vitro. Os embriões que clivaram para o estágio de 2 células foram transferidos para os ovidutos de fêmeas e após 19 dias de gestação, duas fêmeas produziram um filhote cada, porém apenas um sobreviveu.Resultados após um cultivo de dois passos foram relatados em humanos por TELFER et al. (2008), os quais mostraram que, sob certas condições, é possível alcançar o desenvolvimento acelerado de oócitos a partir de folículos primordiais/primários. Nesse trabalho, biópsias ovarianas de mulheres com idades entre 26 e 40 anos foram obtidas e fragmentadas. Os fragmentos foram cultivados in vitro por 6 dias (primeiro passo) e no final deste período, os folículos secundários (100 µm ± 3,4) foram isolados e cultivados por 4 dias (segundo passo). Os folículos secundários cresceram (diamêtro médio 143 µm ± 7.4) e formaram o antro. Recentemente, também em humanos (MCLAUGHLIN et al., 2018), biópsias ovarianas de mulheres com idades entre 25 e 39 anos foram obtidas, fragmentadas e cultivadas in vitro por 8 dias (primeiro passo). Após esse período, os folículos secundários com diamêtro variando entre 100–150 μm foram isolados e cultivados por 8 dias (segundo passo). Em seguida os complexos cumulus-oócitos foram recuperados e cultivados por mais 4 dias (terceiro passo). Os complexos contendo oócitos com diâmetro superior a 100 μm foram selecionados e maturados in vitro por 24 horas (quarto passo). A taxa de maturaçao obtida foi de 28%. Os resultados mostraram que o desenvolvimento de oócitos até a maturação meiótica pode ser alcançado a partir folículos pré-antrais presentes no tecido ovariano humano (MCLAUGHLIN et al., 2018).