Sistemas do complexo CNE:L6

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O primeiro sistema holo a ser estudado foi o complexo CNE:L6, que é composto por um ligante de 6 anéis localizados nas posições (-4,-3,-2,-1, +1,+2). Como no caso da estrutura apo, a melhor forma de visualizar o comportamento da estrutura holo (ver Figura11) é com a comparação de mobilidade com dados experimentais (RMSF vs Fator B). Nesta comparação mostrada na Figura 30, se pode observar como os dados teóricos reproduzem bem as medidas experimentais.

Figura 30. Gráfico dos fatores B experimentais e das estruturas do complexo CNE:L6 e apo da enzima CNE. Se pode observar a redução dos picos entre os resíduos 40 e 60 com a presença do substrato na forma holo. Esta redução poderia ser explicada devido as interações do ligante com os resíduos dessa região o que reduz a mobilidade.

A redução na amplitude do pico entre os resíduos entre 40 e 60 é o fenômeno mais evidente. Análises de ligação de hidrogênio mostraram interação entre o substrato e vários resíduos do loop 40-60. Portanto, o substrato mostrou-se como um elemento estabilizador nessa região da enzima; os resíduos importantes nesta interação com o loop 40-60 foram o Thr43 e o Asn41. O Asp76 também apresentou grande interação com o ligante na posição -3 e, portanto, foi importante para estabilização do loop existente entre os resíduos 66 e 85. Outras características estruturais apresentadas nesta proteína foram as interações entre as posições +2, +1 com os resíduos catalíticos (Glu187 e Glu92) e com His239. Esta última interação da His239 com a posição +1 do ligante permitiu a formação de um túnel formado pela interação da histidina com Glu98. A posição -1 apresentou também forte interação com o resíduo Asn237 o qual está associado a uma alfa hélice perto do resíduo

His239, desta foram a interação His239 e o Glu98 tira o resíduo Asn237 até o ligante contribuindo com a existência desta interação

Figura 31. Complexo CNE:L6 mostrando as principais interações do substrato com os resíduos da fenda catalítica. Os principais loops são amostrados em cores e correspondem a regiões de alta mobilidade as quais se vem reflexadas gráfico de fator B na Figura28. O fenômeno mais importante foi a forte interação que existe entre o Glu98 e o His239.

Ao longo da simulação observou-se a formação de um túnel na cavidade de ligação, que se dá entre os resíduos Glu98 e His239. A Figura 32 se pode visualizar a superposição de várias estruturas extraídas ao longo da trajetória gerada pela dinâmica molecular. Este fenômeno de abre-fecha é um fenômeno bastante importante desde o ponto de vista estrutural e da eficiência catalítica pois influencia sobretudo a estabilidade do complexo enzima-substrato, como discutido na próxima seção deste.

Figura 32. Estrutura CNE holo em diversas poses evidenciando o fenômeno de abre e fecha. (A)Resíduos His239 e Glu98 abertos na fenda catalitica. (B) Residuos His239 e Glu98 fechados na fenda catalitica (C) Dois frames mostrando os residuos His239 e Glu98 abertos (laranja) e fechado (azul)

3.2.3 Sistemas do complexo CNE:L5

Neste sistema os sub-sítios do ligante vão desde a posição -3 até a posição +2, como mencionado na metodologia. Na Figura 33 se pode observar o gráfico de fator B, para este complexo junto com os fatores B experimentais e do complexo CNE:L6.

Frame fechado

Figura 33. Gráfico dos fatores B experimentais e das estruturas dos complexos CNE:L5 e CNE:L6. Se pode observar a redução dos picos entre os resíduos 40 e 60 da L5 em relação a L6. Esta redução poderia ser explicada devido as interações do ligante com os resíduos dessa região o que reduze a mobilidade da mesma

Os valores apresentam boa correlação entre a curva experimental como na simulada. Uma observação importante é o aumento do pico entre os resíduos do loop 40-60 o que é consequência do encurtamento do ligante na extremidade não redutora (a posição -4 não existe mais e só existe a -3) o que reduz as interações do ligante com este loop. A mesma ideia pode explicar a ligeira redução do pico entre os resíduos 80 e 110 assim como a boa correlação dos gráficos dos complexos CNE:L5 e CNE:L6 no restante do gráfico (as posições que ficam iguais, interagem com as mesmas regiões que no complexo CNE:L6).

Desde o ponto de vista estrutura, no complexo CNE:L5 exibe maior interação do resíduo Glu98 com a posição -3 do ligante. Interações fortes se repetem entre o ligante e a proteína como no complexo CNE:L6, por exemplo os resíduos His239, Asn41, Glu98 e Ala134. Nesta proteína os eventos de formação do túnel não se apresentaram como no complexo CNE:L6 devido à maior interação do Glu98 com a extremidade redutora (posição -4 ou -3) do ligante o que não permitiu que o túnel

fechasse. Os loops de interesse que são entre os resíduos 42-63, 66-85 e 89-105, apresentaram mobilidade ligeiramente maior em comparação ao complexo CNE:L6, o qual era de se esperar tomando em conta que um ligante de menor tamanho faz menos interações com a proteína o que denota maior liberdade de movimento para os loops antes mencionados. A Figura 34 mostra os principais resíduos que interagem com o substrato neste complexo.

Figura 34. Complexo CNE:L5 mostrando as principais interações do substrato com os resíduos da fenda catalítica. Os principais loops são amostrados em cores e correspondem a regiões de alta mobilidade as quais se vem reflexadas gráfico de fator B na Figura28. Nesta simulação não se observou a formação do túnel como no complexo CNE:L6. O loop entre os resíduos 42 e 63 apresentou uma maior mobilidade devido a uma menor interação com a extremidade não redutora

3.2.4 Sistemas do complexo CNE:L4

No sistema do complexo CNE:L4 os sub-sítios do ligante encontram-se nas posições +2, +1,-1 e -2. Observou-se que o ligante ficou estável dentro da fenda catalítica similarmente aos complexos CNE:L5 e CNE:L6. Na Figura 35 se pode observar os valores de fator B experimental para o complexo CNE:L4 e com o sistema

CNE:L6.

Figura 35. Gráfico dos fatores B experimentais e das estruturas dos complexos CNE:L4 e CNE:L6. Se pode observar a redução dos picos entre os resíduos 80 e 120 da L4 em relação a L6. Esta redução poderia ser explicada devido as interações do substrato com os resíduos dessa região o que reduze a mobilidade da mesma. Ao substrato ser mais curto, a extremidade redutora fica mais perto dos resíduos da região antes descrita e aumenta as interações com eles.

O loop entre os resíduos 40 e 60 ficou com uma maior mobilidade que era o esperado para um substrato de menor comprimento e, portanto, menos interações com os resíduos desse loop. Entre os resíduos 85 e 115 há uma redução do pico que se deve ao loop 89-105 ter aumentado sua interação com a extremidade não redutora do ligante que agora fica mais perto deste loop em comparação com os complexos CNE:L5 e CNE:L6). Nos outros picos não há diferenças importantes já que se conservaram as mesmas interações correspondentes as posições +2, +1 e -1 do substrato em relação com os outros complexos estudados. Na Figura36 se podem observar as principais interações mostradas no complexo ao longo da dinâmica.

Figura 36. Complexo CNE:L4 mostrando as principais interações do substrato com os resíduos da fenda catalítica. Os principais loops são amostrados em cores e correspondem a regiões de alta mobilidade as quais se vem reflexadas gráfico de fator B. Nesta simulação não se observou a formação do túnel como no complexo CNE:L6. O loop entre os resíduos 42 e 63 apresentou uma maior mobilidade devido a uma menor interação com a extremidade não redutora da mesma forma que o complexo CNE:L5. Uma maior interação da extremidade não redutora com os resíduos do loop 89-105 reduziu a mobilidade do mesmo como se pode ver reflexado no gráfico na Figura33.

O principal resíduo que interage com o ligante é o Trp69 o qual interage com extremidade não redutora (posição -2) do substrato cerca de 33% do tempo da simulação. Da mesma forma o anel na posição -2, também mostra forte interação com o His239 que foi um resíduo chave nos complexos anteriores. Na posição -1 há uma interação com os resíduos His239, Glu187 (resíduo catalítico) e Asn91. Na posição +2 há interação importante com Tyr161 e Asp194.

3.2.5 Sistemas do complexo CNE:L3

Para o complexo CNE:L3 foram feitas 2 simulações nas configurações CNE:L3- 1 (-1,-1, +2) e CNE:L3-2 (-2,-1, +1). Para o sistema CNE:L3-1 ocorreu também a saída do substrato em duas simulações, mas tardaram um pouco mais em comparação ao complexo CNE:L3-2, como se pode observar nas Figuras 37A e 37B. Da mesma forma que no sistema anterior (AME), a falta de estabilidade dos complexos entre CNE

e L3 sugerem que substratos de 3 ou menos anéis de glicose não podem ser clivados pela enzima.

As triplicatas em ambos sistemas confirmam a saída do substrato e mostram que a enzima não permite a ligação do L3 com a fenda catalítica. As distâncias foram medidas entre Glu92 e o oxigênio na posição 3 do anel do ligante na posição -1 no complexo CNE:L3-1 e do anel na posição -2 no complexo CNE:L3-2. A formação do túnel descrito para o complexo CNE:L6 não foi observada nestes sistemas como era de se esperar, mas se observaram algumas interações dos ligantes com o resíduo His239. A ausência do túnel nesta configuração pode explicar pelo comprimento insuficiente do ligante que permita interagir com o His239 e de alguma forma fechar o túnel.

Figura 37. Distancias entre o Glu92 e o oxigênio na posição 3 do anel do ligante na posição -1 para A) Complexo CNE:L3-1 e B) Complexo CNE:L3-2. Em ambos gráficos se pode observar a saída do carboidrato da fenda catalítica da enzima, o que dá entender que só para complexos maiores os iguais a 4 anéis vão ser clivados pela enzima e ligantes de 3 o menos anéis não.

3.3 Formação do túnel na enzima CNE e comparação estrutural entre CNE e AME

Nesta seção, será abordada em maior detalhe, a formação do túnel no complexo CNE:L6 e sua relação com a eficiência catalítica da enzima. Também serão discutidas algumas semelhanças e diferenças estruturais importantes entre AME e CNE.

3.3.1 Formação do túnel entre os resíduos His239 e Glu98 na enzima CNE Na descrição do complexo CNE:L6 na subseção 3.2.2 mencionamos a ocorrência de um túnel formado pelos resíduos His239 e Glu98 os quais se encontram em dois loops, entre os resíduos 238-256 e 89-105, respectivamente, como mostra a Figura 32. Desde o ponto de vista físico, esperava-se que estivesse acontecendo uma ligação de hidrogênio entre os resíduos mencionados.

Para investigar melhor a hipótese anterior, estendeu-se o tempo de simulação

até 300 ns e foi quantificada a distancia entres os resíduos His239 e Glu98 ao longos do tempo, da mesma forma, foi feito um histograma de frequências e um diagrama de energia livre a partir do histograma de frequências. A Figura 38 mostra os gráficos descritos:

Figura 38. Distância entre os resíduos His239 e Glu98. (A) Distancias para uma simulação de 300ns. (B) Histograma de frequências mostrando a frequência relativa da distribuição de distancias entre os resíduos Glu98 e His239, se pode observar um pico em distancias inferiores a 5 Å, sugerindo a existência de uma ligação de hidrogênio entre os resíduos. (C) Gráfico de energia livre mostrando uma maior quantidade de estados entre 3,5 e 5 Å o que dá a entender uma maior probabilidade de existência de uma interação nessas distancias.

A evolução temporal da Figura 38A e a curva de distribuição da Figura 38B mostram claramente tendência dos resíduos a ficar próximos a distâncias menores que 5 Å, sugerindo fortemente a formação de ligações de hidrogênio His239-Glu98 para o complexo CNE:L6. A distribuição de probabilidades pode ser, ainda que de maneira muito preliminar (Figura 38B), ser associada a um diagrama de energia livre configuracional ou potencial de força média associada à distância entre estes resíduos como coordenada de reação (Figura 38C). A energia livre associada a distância foi calculada com a seguinte equação

∆𝑮 = −𝑹𝑻𝒍𝒏 (𝑷𝑩

Onde R é a constante dos gases ideais, T, a temperatura ótima da enzima CNE e 𝑃𝐵⁄ o numero de estads configuracionais possíveis entre o numero de 𝑃𝐴 configurações totatis, o que seria equivalente em nosso caso a distribuição de frequências de distancias

É importante mencionar que para a estrutura apo, a formação deste túnel entre os resíduos não foi observada. Este processo de formação do túnel pode ser um elemento chave ao momento de avaliar a eficiência catalítica desta proteína, já que pode regular os processos de ligação de substrato e liberação do produto, como discutido a seguir. Na Figura 39 se pode observar o gráfico de distâncias e energia livre entre os resíduos His239 e Glu98 para a enzima CNE na forma apo. Pode-se observar que ligações de hidrogênio entre estes resíduos quase não ocorrem e que conformações abertas entre estes dois loops predominam na forma apo.

Figura 39. Distância entre resíduos His239 e Glu98 na estrutura CNE apo para 300 ns. (A) Pode-se observar a pouca tendência dos resíduos a permanecer a distâncias menores a 5 Å e por tanto à formação de ligação de hidrogênio. (B) Diagrama de energia livre que mostra um mínimo entre 4 e 6 Å e poucos estados menores a 5 Å o que mostra pouca existência de estados em estas distancias

Para entender melhor o processo de formação deste túnel foi estudadas também as simulações dos pentâmeros em duas posições distintas na fenda catalítica: os complexos CNE:L5 e CNE:L5-5. O sistema CNE:L5-5, foi sugerido pelo grupo do Dr. Mário Murakami como um sistema de interesse que poderia ajudar no entendimento do processo de formação do túnel. O complexo CNE:L5-5 corresponde a um ligante com um comprimento de 5 anéis de glicose nas posições (-5,-3,-2,-1, +1) dentro da fenda catalítica. Durante a simulação deste sistema, não se observou formação do túnel, como mostra a evolução temporal da distância entre os resíduos His239 e Glu98 exibida na Figura 40.

Figura 40. (A)Distancias entre os resíduos His239 e Glu98 no complexo CNE:L5-5. Não se observa ligação de hidrogênio ao longo da trajetória entre estes resíduos. Cada cor representa a média de uma simulação distinta para melhor visualização. . (B) Diagrama de energia livre que mostra um mínimo entre 4 e 6 Å o que mostra pouca existência de estados menores a estas distancias

O gráfico em triplicata, não mostra uma formação do túnel em nenhuma das 3 triplicatas e por tanto se pode evidenciar que neste sistema o fenômeno não acontece. Da mesma forma que na estrutura apo, no diagrama de energia livre não apresentaram muitos estados em distâncias menores a 5 Å. Nesta simulação, observou-se uma interação do anel na posição -5, correspondente à extremidade não redutora com o resíduo Val100 que “puxou” o loop entre os resíduos 89-105 onde está

o Glu98 e, consequentemente, não permitiu a formação do túnel com o resíduo His239. Este resultado sugere a importância deste loop na formação do túnel (ver Figura 41). Para quantificar a interação da Val100 com o ligante, foi realizada uma análise de ligação de hidrogênio, a qual indicou que a interação específica entre a Val100 e o ligante ocorre cerca de 30% do tempo de simulação.

Figura 41. Complexo CNE:L5-5 mostrando a interação entre a Val100 e o subsítio -5 que corresponde a extremidade não redutora. Esta interação da extremidade não redutora com o resíduo Val100 não permite que loop 89-105 fique com a liberdade suficiente para que aconteça a interação entre o Glu98 e o HIS239. Este sistema só foi simulado para tentar entender este fenômeno.

No complexo CNE:L5, o cálculo da porcentagem do tempo no qual acontecem ligações de hidrogênio entre o substrato e a proteína indica que a posição -4 (extremidade redutora) dos anéis do ligante interage cerca 11% do tempo com o Glu98. Esta interação da extremidade redutora impede a formação do túnel com o resíduo His239. Durante o curso das simulações, interações mais efetivas entre o resíduo Glu98 e o ligante no complexo CNE:L6 ocorreram muito raramente. Este fenômeno sugere que a posição -4 na estrutura L6 é chave no momento da formação do túnel já que uma maior distância entre o Glu98 e a extremidade redutora, deixa a este último resíduo mais livre para poder interagir com o His239. Para quantificar

H239

E98 V100

melhor estes eventos, monitorou-se a distância entre os resíduos His239 e Glu98 da mesma forma que no complexo CNE:L5-5 e CNE:L6 (ver Figura 42)

Figura 42. Distâncias entre os resíduos His239 e Glu98 do complexo CNE:L5. Se observa ligação de hidrogênio ao longo da trajetória entre os resíduos. Cada cor representa a média de uma simulação distinta para melhor visualização. . (B) Diagrama de energia livre que mostra poucos estados menores a 5 Å o que dá a entender a pouca existência de estados menores a estas distancias.

O gráfico anterior mostra a baixa incidência de distâncias inferiores a 5Å, tanto na distância no tempo tanto como na distribuição de probabilidades, indicando ausência de ligação de hidrogênio entre os resíduos Glu98 e His239.

Figura 43. Complexo CNE:L5, pode-se observar como a extremidade não redutora do substrato interage com o resíduo Glu98 não tirando todo o loop e não permitindo a formação do túnel com o resíduo His239.

Para o complexo CNE:L4 o loop entres os resíduos 89-105 exibiu uma maior liberdade de movimento devido às poucas interações existentes entres os resíduos do loop com o substrato. Da mesma forma que os sistemas CNE:L4, CNE:L5 e CNE:L5-5 não foram observados eventos de formação do túnel. Na Figura 44 se pode observar da mesma forma que os sistemas anteriores, um gráfico com a distâncias entre os resíduos Glu98 e His239 e o gráfico de energia livre que mostra os poucos estados em distâncias menores a 5 Å.

Estudos de ligação de hidrogênio entre o substrato e a enzima mostraram uma interação importante entre a extremidade não redutora (posição -2) e o resíduo His239 que faz que este resíduo fique interagindo como esse extremo do ligante, não permitindo a interação com o resíduo Glu98, impedindo, assim, a formação do túnel como no complexo CNE:L6. Portanto, para o caso do complexo CNE:L4, a interação da extremidade não redutora com o resíduo His239 não permitiu a formação do túnel.

Figura 44. (A) Distâncias entre os resíduos His239 e Glu98 do complexo CNE:L4. Observa-se pouca ligação de hidrogênio ao longo da trajetória entre os resíduos. Cada cor representa a média de uma simulação distinta para melhor visualização. (B) Diagrama de energia livre que mostra poucos estados menores 5 Å o que dando a entender a pouca existência de estados menores a estas distancias

Por último, nos sistemas CNE:L3, não houve a formação do túnel, pois a saída do carboidrato converte à enzima praticamente a uma enzima de forma apo e, portanto, seria feita a mesma análise feito na primeira parte desta seção. Nas Figuras

45A e 45B se pode observar os gráficos em triplicata das distâncias entre os resíduos His239 e Glu98 para os complexos CNE:L3-1 e CNE:L3-2

Figura 45. Distâncias entre os resíduos His239 e Glu98 para Complexos CNE:L3-1 e CNE:L3-2. Pode-se observar pouca as nenhumas distâncias menores a 5Å o que se pode entender como ausência de ligação de hidrogênio, neste sistema é esperado já que ao sair o carboidrato é equivalente a um sistema apo.

3.3.2 Comparações estruturais entre as enzimas AME e CNE e seu papel nas diferencias de eficiência catalítica.

As diferenças estruturais presentes em ambas as enzimas junto com a formação do túnel, podem explicar as diferenças entre as eficiências catalíticas. Desde o ponto de vista estrutural, a principal diferença entre ambas enzimas foi a inexistência do túnel descrito na seção anterior. Na Figura 46 se pode observar a semelhança estrutural entre ambas as enzimas quando forem alinhadas.

Figura 46. Estruturas das enzimas AME e CNE alinhadas. Pode-se observar a similitude entre ambas estruturas.

Pode-se observar que regiões similares de ambas enzimas perto da fenda catalítica apresentam uma série de diferenças com implicações para a mobilidade e comportamento de loops importantes para o funcionamento das enzimas. A principal diferença foi o comprimento dos loops em regiões similares, por exemplo, na CNE o loop entre os resíduos 238 até 256 tem 18 resíduos, mas na região similar da enzima AME há um loop de apenas 3 resíduos (248-250). Esta diferença de comprimentos faz com que os loops da enzima AME apresentem uma maior rigidez estrutural permitindo que a fenda catalítica fique completamente aberta no decurso das dinâmicas. Caso similar acontece se apresentou para o loop 89 até 105 na enzima CNE (que contém o resíduo Glu98) e o loop entre os resíduos 100 até 112 da AME. Para ambos casos, o comprimento do loop é maior para a CNE (16 resíduos) que para a AME (12 resíduos), o que confere uma maior liberdade de movimento na enzima CNE para a formação do túnel.

Uma região de interesse também poderia ser o loop 41-62 da enzima CNE qual exibiu uma estabilidade bastante evidente no complexo CNE:L6. A região equivalente

na enzima AME:L6 seria entre os resíduos 56-70 a qual como nos loops anteriormente

No documento Dinâmica molecular de uma nova família de Glicosil Hidrolases (GH-X) (páginas 64-91)