SOBREVIDA

Como descrito anteriormente, a sepse caracteriza-se pelo desencadeamento de SIRS relacionado a uma infecção, no entanto, a sepse pode evoluir apresentando quadros de disfunção orgânica secundária, passando a ser definida como sepse grave e, por fim, instabilidade cardiovascular, requerendo vasopressores, definindo o quadro de choque séptico (MEDICINE, 1992 ). Os quadros de sepse evoluem de acordo com o tempo e a

resposta inflamatória do individuo, quando a resposta é, ainda, controlada existe um equilíbrio entre os mediadores anti e pró inflamatórias restaurando-se a homeostase. No entanto, quando há avanço da infecção consequentemente a perturbação deste equilíbrio levando ao desencadeamento de SIRS, desencadeando processos de disfunção e, posteriormente, falência múltipla de órgãos (BONE,GRODZIN AND BALK, 1997).

Para realização dos teste de sobrevida os camundongos foram pré tratados (15 minutos antecedentes a aplicação da suspensão bacteriana) com as diferentes amostras, sendo elas peptídeo nanoestruturado, peptídeo livre, a nanoestrutura sem o peptídeo e os controles positivo (cloranfenicol 40 g.ml-1 _{) e negativo (animais não tratados). Em seguida}

foram administradas doses dos tratamentos referentes a cada grupo (2, 4 e 12 g.ml-1_{). As}

doses foram administradas a cada 24 h, objetivando a observação da sequência terapêutica durante sete dias (tempo total de observação). De acordo com os resultados obtidos (Figura

22) foi possivel observar uma sobrevida, ao fim do sétimo dia, de 100 % dos animais induzidos a sepse subletal tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A, utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo. Para os animais tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A (12 e 4 g do peptídeo) observou-se uma taxa de sobrevida de 20%. Os animais tratados com a estrutura sem o peptídeo apresentaram 80% de sobrevida. Para o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada sobrevida.

Figura 23. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse subletal intraperitoneal, com administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e K.

pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e

a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A).

Os resultados obtidos pela curva de sobrevida dos animais induzidos a sepse letal (Figura 23) demosntraram diferenças significativas dos resultados obtidos para sepse letal. Neste caso, os animais tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A, utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo, apresentaram 40% de sobrevida ao fim do sétimo dia. O grupo tratado com as estruturas sem o peptídeo observou-se uma taxa de sobrevida de 20%, o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada sobrevida. Nanop. Nano + Pep. 2 g Nano + Pep. 12 g Nano + Pep. 4 g Pep. 12 g

Figura 24. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse letal intraperitoneal, com administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o

peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A).

A análise dos dados permite observar que a taxa de sobrevida dos animais durante o experimento varia de acordo com o tempo de indução à sepse. Neste sentido foi possível observar que a evolução do quadro de sepse para os animais não tratados (letal), tratados somente com a estrutura (Nanop.) e tratados com o peptídeo livre (Pep.) não se modifica após o segundo dia, sendo apenas 20% sobreviventes após 48 h de experimento. Para os animais tratados com as nanopartículas associadas à clavanina A (2 g) a taxa de sobrevida observada foi de 80 % até o segundo dia e de 60 % do segundo ao sexto dia. Estudos posteriores poderão demonstrar se esta relação poderá prolongar o tempo de tratamento, quando associado a outros antibióticos já utilizados. Alem disso, os resultados sugerem fortemente que o efeito observado pode estar relacionado a atividade imunomodulatória associada a atividade antibiótica do peptideo, novos experimentos poderão elucidar essa caracteristica imunomodulatória.

O modelo de sepse caracterizado pela administração intraperitoneal da bactéria viva ou de componentes microbianos tem sido muito utilizado para observação de sobrevida de

0 1 2 3 4 5 6 7 0 20 40 60 80 100 Nano Pep 2 ug Estrutura 50 ul Letal Pep. Livre 12 ug

Dias após a Sepse

S

o

b

re

vi

d

a

(%

)

modelos animais. Essa metodologia reproduz os sintomas da sepse, demonstrando uma real proximidade do quadro de sepse observado em casos clínicos, uma vez que o processo se inicia a partir do foco infeccioso induzido na cavidade peritoneal, sendo disseminado de forma rápida. Giacometti e colaboradores (2002) demonstraram a atividade de três proteínas sendo elas a buforina II (BUF), a indolicidina (IND) e a sequência KFFKFFKFF (KFF), em três diferentes formas de indução da sepse por E. coli (infusão intraperitoneal de LPS, infusão intraperitoneal de colônias bacterianas, perfuração do ceco). Inicialmente não foi observada diferença significativa entre os resultados obtidos para cada metodologia. Para as metodologias de administração de LPS e infusão de colônias bacterianas não foi observada sobrevida para os grupos controle, para os grupos tratados com as amostras de BUF, IND e KFF, respectivamente, 26, 40 e 53 % de sobrevida nos grupos em que foi utilizada a infusão intraperitoneal da bactéria e 33, 53 e 66% de sobrevida, respectivamente (GIACOMETTI,CIRIONI,GHISELLI ET AL., 2002).

Cirioni e colaboradores (2002) demonstraram o uso das magaininas I (M1), II (M2) e magainina II amidada (M2-NH2) no tratamento contra sepse bacteriana. Para isso os autores

induziram a sepse em camundongos por infusão intraperitoneal de colônias de E. coli. Os autores demonstraram que 86,7% dos animais não tratados não sobreviveram, os grupos tratados com M1, M2 e M2-NH2 apresentaram, respectivamente, 73,3; 80 e 66,7 % de

sobrevivência (CIRIONI, GIACOMETTI, GHISELLI ET AL., 2002). Coopersmith e colaboradores (2002) demonstraram a relação entre o nível de apoptose celular no intestino de pacientes com sepse bacteriana e os níveis de mortalidade encontrados. Para isso os autores utilizaram camundongos previamente induzidos a super-expressão da proteína antiapoptótica BCl2. Os animais foram, posteriormente, induzidos a sepse por infusão intraperitoneal de colônias de P. aeruginosa, a sobrevida observada foi de 40% dos animais com a super expressão protéica contra 4 % dos animais controle (COOPERSMITH, STROMBERG, DUNNE ET AL., 2002). Os estudos acima descritos apresentam o uso de peptídeos antimicrobianos utilizados no controle de infecções septicêmicas. Entretanto o uso de nanopartículas poliméricas contendo peptídeos antimicrobianos não foi, ainda, relatado o que dificulta uma comparação exata.

6.3.1 Análises de migração de neutrófilos após indução de sepse

Como anteriormente descrito, a sepse resulta da complexa interação entre o micro- organismo infectante e a resposta imune, pró-inflamatória e pró-coagulante do hospedeiro, desta forma a resposta imune inata pode ser responsável pelo processo inflamatório inicial da sepse, a qual corresponde a alterações relacionadas a oferta de oxigênio e substratos,

levando as células a reagir à agressão séptica modificando seu comportamento, função e atividade. Apesar dos mecanismos de disfunção orgânica não estarem completamente elucidados estes mecanismos podem ser classificados em sistêmicos ou orgão específico. Desta forma a resposta imune em relação a sepse pode desencadear tanto uma resposta imune exagerada quanto a falta de resposta imune levando a falência multipla dos orgãos, a depender do tempo de evolução da doença (HENKIN ET AL., 2009).

De acordo com os dados obtidos pela contagem total e diferencial das células retiradas do lavado peritonial dos camundongos foi possivel observar que os camundongos tratados com o antibiotico comercial, cloranfenicol 40 g.ml-1 _{(c+), os animais não tratados,}

e os animais tratados somente com a nanoparticula, sem o peptídeo, apresentaram niveis simililares de migração de neutrófilos (Figura 26). No entanto, segundo a análise estatística por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,0001 , realizada com auxilio do software GraphPad Prism 5, não houve diferença significativa entre os grupos testados.

Figura 25. Análises de correlação de sepse e migração, realizadas após a indução de sepse letal por via intraperitonial, com administração dos tratamentos de cada grupo. Os grupos foram divididos em Letal, controle positivo (C+), 2 g de peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nano). A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli,

P. aeruginosa e K. pneumoniae. O lavado peritoneal foi obtido após 6 horas de indução de sepse. A

análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras foram comparadas entre sí, objetivando demonstrar sua similaridade (*).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Letal C+ Pep. Nano.

(2 ug) Nano N e ut ró fi los x 1 0 3 l

*

*

*

*

Segundo Fialkow e colaboradores (2006) a apoptose de neutrófilos pode ser inversamente proporcional a gravidade da sepse, neste sentido quanto maior a presença de neutrófilos, mais facilmente pode-se controlar a infecção. Desta forma, o aumento na

contagem de neutrófilos encontrada para os animais tratados com a nanoestrutura contendo a clavanina A, pode ser associada a regulação do tempo de evolução da sepse, aumentando o tempo entre a infeção dos animais e a falência multipla dos orgãos (FIALKOW,

FOCHESATTO FILHO, BOZZETTI ET AL., 2006). Alves-Filho e colaboradores (2005) demonstraram a importância da migração de neutrófilos para o foco infecioso, uma vez que estes são capazes de controlar o desenvolvimento bacteriano e estimular a ativação de outras celulas do sistema imune (ALVES-FILHO, BENJAMIM, TAVARES-MURTA ET AL., 2005). Benjamim e colaboradores 2000 demonstraram a deficiência de migração de neutrófilos em camundongos submetidos a sepse letal e subletal, os autores relacionam o aumento da deficiência ao estado de sepse, uma vez que os animais submetidos a sepse subletal apresentaram maior migração de neutrófilos e menor número de bactérias no exsudato peritoneal (BENJAMIM,FERREIRA AND CUNHA, 2000). Desta forma conclui-se que a

concentração diminuta do número de neutrófilos encontrada nos animais não tratados e dos tratados com o cloranfenicol 40 g.ml-1 _{e com as nanoestruturas sem o peptídeo, podem se}

relacionar ao maior desenvolvimento bacteriano. Para os animais tratados com as nanopartículas associadas ao peptídeo antimicrobiano, os quais apresentaram niveis maiores de migração de neutrófilos, pode-se relacionar a um leve aumento de atividade imunológica contra a infecção.