MICOTECA URM, BRASIL
Artigo a ser submetido a MYCOSES
*Kaliny Benicio Torres, Oliane Maria Correia Magalhães, Hanilma da Silva Rodrigues, Cristina Maria de Souza-Motta
Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil
* Autor correspondente
Endereço: Rua Gervásio Pires, nº 436, Bloco-B, Aptº 110, Boa Vista, Recife, Pernambuco, Brasil. Cep 50050-070.
Telefone: (+5581) 2126-8948 Fax: (+5581) 2126-8480
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Resumo
Viabilidade, pureza e caracteres morfológicos e fisiológicas, como crescimento a 37°C e atividades queratinofílica/queratinolítica, ureásica, fosfolipásica e proteinásica de 9 isolados de Sporothrix schenckii preservdos na Micoteca Universidade Recife Micologia, Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, por 16 anos em água destilada esterilizada foram avaliados. Oito das 9 estavam viáveis e conservaram suas características morfológicas típicas. Todos os isolados foram capazes de crescer a 37°C e apresentaram atividade queratinofílica, entretanto, nenhum apresentou atividade fosfolipásica ou ureásica. Para atividade proteinásica, todos foram positivos quando o substrato utilizado foi gelatina e foram negativos quando o substrato foi caseína. Isolados de S. schenckii são preservados satisfatoriamente pelo método de preservação em água destilada esterilizada por até 16 anos, mantendo seus caracteres morfológicos e fisiológicos.
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Introdução
Sporothrix schenckii (Hektoen & Perkins) é um fungo dimórfico cosmopolita já relatado em
vários países: México, Uruguai, Brasil, E.U.A., Japão e Índia [1]. É o agente etiológico da esporotricose, uma infecção subaguda ou crônica da pele e tecidos subcutâneos com várias forma clínicas e cujo diagnóstico é feito por exames micológicos, histopatológicos e imunológicos [2-3].
A preservação de culturas de fungos assegura a viabilidade e integridade morfológica, fisiológica e genética das culturas até serem requerido para estudos e pesquisas futuras [4-6]. O método de Castellani [7-8] foi usado prosperamente para preservar fungos patógenos humanos e animais [4, 9-10], entre eles os dimórficos.
O potencial patogênico de alguns fungos foi relacionado com a capacidade de produzir enzimas extracelulares e de crescimento na temperatura corpórea do hospedeiro, o que favoreceria a adesão e invasão do tecido, bem como a disseminação do agente etiológico após a ruptura da barreira de proteção tecidual [3, 11].
Este paper visa verificar a viabilidade, pureza, estabilidade morfológica e caracteres fisiológicos de isolados de S. schenckii preservados em água destilada esterilizada na Micoteca Universidade Recife Micologia (URM), Brasil.
Materiais e Métodos
Isolados - 9 isolados de Sporothrix schenckii preservados em água destilada esterilizada em 1991 (16 anos) e mantidos a temperatura ambiente (28ºC 2ºC) na coleção de culturas Micoteca URM, Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil, foram utilizados.
Viabilidade, pureza e estabilidade morfológica - As culturas foram transferidas dos frascos de penicilina para placas de Petri contendo meio de cultura batata dextrose ágar
69 (BDA), no qual foram preservados e mantidos a temperatura ambiente por até 15 dias [7-8]. Após o crescimento, a pureza e a estabilidade morfológica foram avaliadas observando-se caracteres macroscópicos através de colônia central em BDA e caracteres microscópicos através de técnica de microcultivo, também em BDA, e preparação de lâminas com lactophenol azul de algodão, visualizadas sob microscópio ótico [3, 12].
Caracteres fisiológicos - Todos os testes foram realizados em triplicata.
Crescimento a 37ºC - Este teste foi realizado conforme Lima & Borba [13]. Os isolados foram inoculados em caldo Brain Heart Infusion (caldo BHI) e incubados a 37°C em
shaker a 120 rpm por 7 dias.
Atividade queratinofílica/queratinolítica - Suspensões em 9mL de solução salina com 1,0g de Tween 80 (106 esporos ml-1) foram preparadas e distribuídas em placas de Petri contendo 25g de solo e 5 pontos de pedaços de crina de cavalo de aproximadamente 2cm de comprimento. Todo conjunto previamente esterilizado. As placas foram mantidas a temperatura ambiente por 30 dias, removendo-se 5 crinas a cada 10 dias e lâminas foram feitas com uma gota de lactophenol azul de algodão para observação sob microscópio ótico. A colonização da crina indicou atividade queratinofílica e a colonização/perfuração indicou atividade queratinolítica [14-15]. Cada isolado crescido na crina foi colocado em BDA contido em placas de Petri, mantido a temperatura ambiente e seu crescimento foi acompanhado durante 10 dias para autenticação taxonômica [3, 12].
Atividade ureásica - O teste foi baseado na metodologia de metodologia de Lacaz [3]. Os isolados foram inoculados em tubos contendo ágar Urease Christenson e mantidos a temperatura ambiente por 3 dias. A mudança do meio de amarelo para rosa intenso indicou teste positivo.
70 Atividade fosfolipásica - A metodologia modificada de Price et al. [16], trocando gema de ovo por lecitina de soja, foi utilizada. Os isolados foram inoculados em placas de Petri contendo o meio e mantidos a temperatura ambiente por 10 dias, quando a presença (teste positivo) ou a ausência (teste negativo) de halo opaco ao redor da colônia foi detectada.
Atividade proteinásica - Dois substratos foram utilizados: caseína e gelatina [3]. Quando o substrato foi a caseína, os isolados foram inoculados em placas de Petri contendo o meio de cultura e mantidos a temperatura ambiente por 10 dias. Nas colônias que apresentaram halo transparente ao seu redor, foi adicionada uma solução ácida de cloreto de mercúrio e se esperou 5min para conferir diminuição/desaparecimento (teste negativo) ou permanência (teste positivo) do halo. Quando o substrato foi a gelatina, os isolados foram inoculados em tubos contendo o meio de cultura e mantidos a temperatura ambiente por 10 dias. Em seguida, os tubos inoculados foram refrigerado a 4°C por 30min para observar a liquefação (teste positivo) ou solidificação (teste negativo) do meio (gelatina).
Resultados
Os resultados das experiências estão expostos na Tabela 1.
Os resultados mostraram que 8 (89%) dos 9 isolados foram mantidos satisfatoriamente após 16 anos de preservação. Os isolados reativados foram examinados macro e micrsocopicamente para avaliar a pureza e a conservação de caracteres morfológicos. Nenhum deles apresentou contaminação ou mudanças de caracteres morfológicos, conservando-se a morfologia e a capacidade de esporular observadas antes da preservação. As culturas apresentaram, quando jovens, colônias membranosas brancas e, quando velhas, colônias filamentosas com ou sem pigmento escuro. Foram observadas, microscopicamante, hifas hialinas septadas, conidióforos ramificados e conídios hialinos esféricos a piriformes que surge em buquê ao topo de conidióforos (Figs 1a, b).
71 Com relação aos caracteres fisiológicos, os resultados mostraram que todos os isolados cresceram a 37°C. O crescimento dos isolados mantidos a 37°C foi evidenciado já ao 3º dia, enquanto a temperatura ambiente (28ºC ± 2ºC), este só foi evidenciado à partir do 5º dia. Todos os isolados avaliadaos foram capazes de colonizar a crina de cavalo e esporularam bem já nos primeiros 10 dias. A colonização foi observada tanto na superfície quanto no interior da crina e uma grande quantidade de micélio e esporos foi produzida (Figs 2a, b). Nenhum dos isolados perfurou a crina ao final dos 30 dias. As atividades ureásica e fosfolipásica não foram detectadas no isolados. Todos os isolados apresentaram atividade proteinásica, entretanto, apenas quando o substrate utilizados foi a gelatina. Não foi observado formação de halo transparente ao redor das colônias nas placas contendo meio de cultura com caseína.
Discussão
Taxas de viabilidade de 90% a 100% para grupos de fungos diferentes preservados em água destilada esterilizada foram descritos por muitos autores [4-10, 13, 17-22]. Dos 9 isolados utilizados neste trabalho, only 1 não foi viável, o que confirma a eficiência do método na preservação de Sporothrix schenckii. Resultados similares com este mesmo fungo foram obtidos por Diogo et al. [10] que reativaram 100% de 12 isolados preservados de 6 meses a 1 ano e por Mendoza et al. [6] que reativaram com sucesso 5 isolados após 18 anos de estocagem.
Além de assegurar a viabilidade das culturas preservadas, o método de Castellani as mantém puras e sem alterações morfológicas [5], porém, contaminação e diminuição de capacidade de esporular podem acontecer, o que é mais freqüente em culturas de dermatófitos [21-22]. Neste trabalho todos os isolados viáveis estavam puros e morfologicamente estáveis. Os caracteresr macroscópicos e microscópicos observados foram os mesmos apresentados antes da preservação das culturas. Resultados semelhantes foram encontrados na maioria dos
72 com isolados de Sporothrix schenckii, observaram uma grande variedade de formas de conídios e contaminação em 20% deles.
A habilidade de sobreviver e se multiplicar a 37°C parece ser uma propriedade comum a fungos patogênicos [3, 12]. Lima & Borba [13] e Mendoza et al. [6] verificaram que este carácter fisiológico é conservado em isolados de S. schenckii preservados sob óleo mineral e em água destilada, respectivamente. Igualmente aos resultados obtidos por Lima & Borba [13] e Mendoza et al. [6], Os isolados deste estudo também foram capazes de de crescer a 37°C após serem preservados. Estudos com S. schenckii relatam que isolados ambientais crescem melhor a 30°C e isolados clínicos crescem melhor a 37°C [23-24], entretanto, neste estudo não foram observadas diferenças significativas entre o crescimento dos isolados clínico e ambientais. Todos eles cresceram mais rapidamente a 37°C que a temperatura ambiente (28ºC 2ºC).
A determinação da atividade queratinásica pode ser realizada com diferentes substratos: cabelo, unha, crina, pena, lã, etc. O substrato queratinoso pode ser colonizado e/ou degradado pelos fungos. Aqueles que apenas colonizam tal substrato são definidas como queratinofílicos, enquanto aqueles capazes de destruir a queratina são definidos como queratinolíticos [3, 25]. No presente estudo, todos os isolados foram capazes apenas de colonizar a crina de cavalo, sendo portanto considerados queratinofílicos.
Nenhum isolado apresentou apresentou atividade ureásica ou fosfolipásica, contudo, diferentes resultados foram relatados com relação a detecção de urease em S. schenckii. Singler et al. [24], mostraram que a fase leveduriforme deste fungo hidrolisa uréia, no entanto, Ghosh et al. [1] observaram em seu trabalho que a fase leveduriforme de seus isolados não degradou a uréia, enquanto a fase micelial degradou. Mais tarde, Mendoza et al. [6] observaram que todos os seus isolados apresentaram atividade ureásica a temperatura
73 ambiente (fase micelial). Não foi encontrado nenhum estudo sobre atividade fosfolipásica de
S. schenckii.
Diversos substratos são utilizados em testes de detecção de proteases: gelatina, soro albumina bovina, caseína, entre outros [3]. Neste estudo foram utilizados caseína e gelatina para testar atividade proteinásica, porém, só com gelatina foram observados resultados positivos. Ghosh et al. [1] revelou em seu estudo que nenhum isolados (fases micelial e leveduriforme) hidrolisou caseína ou (fase micelial) gelatina, enquanto, Mendoza et al. [6] obteve 25% de seus isolados capazes de hidrolisar a gelatina a temperatura ambiente.
Estes dados demonstram que culturas de S. schenckii podem ser mantidas durante 16 anos em água destilada esterilizada sem prejuízos para viabilidade, pureza e caracteres morfológicos e sem perder suas atividades queratinofílica e proteinásica. Com relação às atividades ureásica e fosfolipásica, não é possível concluir sobre perda destes caracteres fisiológicos, porque estes não foram avaliados antes da preservação dos isolados.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq, pelo apoio financeiro, e a Micoteca URM por fornecer as culturas.
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76 25 Kushwaha RKS, Guarro J. Biology of Dermatophytes and other Keratinophilic Fungi. Bilbao: Rev Iberoam Micol, 2000.
77 Tabela 1. Viabilidade e caracteres fisiológicos de isolados de Sporothrix schenckii preservados
por 16 anos em água estilada esterilizada na Micoteca URM, Brasil.
Número de registro URM Origem do isolado Viabilidade Crescimento a 37°C AQF/ QL AU AF APC APG 301 ni + + QF - - - + 434 IC + + QF - - - + 435 IC + + QF - - - + 592 ni - nt nt nt nt nt nt 1013 IC + + QF - - - + 2439 ni + + QF - - - + 2848 IA + + QF - - - + 2865 IC + + QF - - - + 4291 IC + + QF - - - +
a) AQF/QL: Atividade queratinofílica/queratinolítica, b) AU: Atividade ureásica, c) AF: Atividade fosfolipásica, d) APC: Atividade proteinásica com caseína como substrato, e) APG: Atividade proteinásica com gelatina como substrato, f) ni: Origem do isolado não informada, g) IC: Isolado clínico, h) IA: Isolado ambiental, i) +: Teste positivo, j) -: Teste negativo, k) nt: Não testado, l) QF: Queratinofílico.
78
Figura 1. Cultura of S. schenckii URM1013 com 15 dias de crescimento em BDA a
temperatura ambiente. a) Macroscopia mostranto colônia membranosa branca. b) Microscopia mostrando hifa hialina (h), conidióforo (cf) e conídios hialinos piriformes (c) surgindo em forma de buquê no topo do conidióforo (4000X).
a b
h c cf
79
Figura 2. Colonização de crina de cavalo (cc) por S. schenckii após 10 dias de
crescimento. a) S. schenckii URM1013 (2400X), b) S. schenckii URM435 (400X). Conidióforo (cf) e conídios (c). a b cc c cf cc c c
80
6 CONCLUSÕES GERAIS
Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:
a) O percentual de viabilidade de culturas preservadas em água destilada esterilizada varia de acordo com o isolado preservado e com o tempo de preservação;
b) O método de preservação em água destilada esterilizada é eficiente para estocagem de culturas de Zygomycetes por até seis anos; já para culturas de dermatófitos e
Sporothrix schenckii, este período pode chegar a 16 anos;
c) O método de preservação em água destilada esterilizada garante a pureza das culturas preservadas e mantem as características morfológica das culturas viáveis, com exceção das culturas de Epidermophyton;
d) Dermatófitos podem crescer a 37°C e apresentar atividades proteinásica e queratinolítica após 16 anos de preservação em água destilada esterilizada;
e) S. schenckii podem crescer a 37°C e apresentar atividades proteinásica e queratinofílica após 16 anos de preservação em água destilada esterilizada
f) A detecção de proteinase em S. schenckii varia de acordo com o substrato utilizado, sendo a gelatina melhor substrato que a caseína.
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