CAPÍTULO IV - ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA EM
IV. 1. SPOT TEST
Há muitas décadas os spot tests têm sido discutidos e explorados, principalmente, em análises clínicas, testes de controle da qualidade do ar, em análises de água e alimentos, em prospecções geoquímicas e em análises forenses (JUNGREIS, 1997). Os spot tests envolvem, basicamente, a mistura de algumas gotas de uma solução contendo a substância de interesse com algumas gotas de uma solução contendo o reagente formando um produto colorido. O meio para a reação pode ser um suporte de superfície porosa, por exemplo, papel de filtro ou sílica gel (JUNGREIS, 1997). Historicamente, Friedlieb Ferdinand Runge, químico alemão, é considerado um dos importantes pioneiros no uso de papel de filtro como suporte para reações químicas (ANFT, 1955). Schönbein e Goppelsroeder (1861) e Schiff (1859) também são citados na literatura como pioneiros, mas a reação mais antiga descrita é àquela realizada por Runge em 1822 (ANFT, 1955). Tal reação foi desenvolvida a partir de um estudo para avaliar o poder de branqueamento de soluções alvejantes através de um teste para detectar a presença de cloro em tais soluções. O teste ocorreu sobre uma superfície de papel de filtro impregnado com amido e iodeto de potássio. Quando gotas da solução alvejante foram adicionadas sobre o papel, uma mancha azul apareceu na superfície devido à liberação de iodo e sua reação com o amido (ANFT, 1955). Esta é, provavelmente, a reação de spot test mais antiga utilizando papel de filtro impregnado e antecede o teste desenvolvido por Schiff, o qual detectou ácido úrico utilizando papel impregnado com carbonato de amônio (ANFT, 1955; JUNGREIS, 1997). Posteriormente, Fritz Feigl se destacou como um grande estudioso das análises por spot test de substâncias orgânicas e inorgânicas, tendo estudado reações mais sensíveis e seletivas e publicado diversos livros científicos (FEIGL, 1966, 1958).
Uma vez que os spot tests levam à formação de um produto colorido, eles podem ser usados para análises qualitativas - quando a detecção da substância de interesse se dá visualmente pela presença de cor; para análises semi-quantitativas – na quais escalas de cores,
feitas com padrões analíticos de diferentes concentrações, são utilizadas para comparação com a intensidade de cor do teste e para análises quantitativas, utilizando, por exemplo, instrumentos para medir a luz refletida, neste caso, a espectroscopia de reflectância difusa.
Para análises semi-quantitativas ou quantitativas, é importante que o procedimento para a realização do spot test seja bem elaborado, visando à obtenção de uniformidade na cor da mancha formada e, conseqüentemente, uma boa precisão das medidas. Detalhes importantes da execução do spot test envolvem o controle do volume da solução a ser adicionada utilizando micropipetas ou microsseringas e da velocidade da adição das soluções, bem como a escolha da ordem de adição que resulte em maior uniformidade da mancha colorida formada (GHAUCH et al., 2000; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; JUNGREIS, 1997).
O fato dos spot tests serem procedimentos especialmente rápidos, simples e que apresentam baixo consumo de reagentes e solventes o tornam muito interessantes para o desenvolvimento de métodos analíticos, principalmente do ponto de vista da Química Verde, a qual tem interesse por métodos e técnicas que reduzem ou eliminam o uso e a geração de substâncias prejudiciais à saúde humana ou ao meio ambiente (ANASTAS, 1999).
Atualmente, a espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot tests tem sido utilizada com sucesso em análises quantitativas (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; DMITRIENKO et al., 2002; FRITZ et al., 2003; GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTÍNEZ; CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ; CAMPÍNS-CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993; NARAYANASWAMY, 1993;
OLIVEIRA; SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; TUBINO; SOUZA, 2006; ZAPOROZHETS; GAWER; SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS et al., 1999;
ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).
IV. 2. ASPECTOS TEÓRICOS DA ESPECTROSCOPIA DE REFLECTÂNCIA DIFUSA A percepção óptica dada por uma substância química é baseada em sua interação com a luz. Absorção, emissão e reflexão ou espalhamento são os três fenômenos mais comumente empregados para medidas analíticas (GHAUCH et al., 2000).
Ao contrário da espectroscopia de absorção que há muito tempo vêm apresentando amplo uso como técnica de análise quantitativa, a espectroscopia de reflectância difusa tem sido pouco estudada. Durante muitos anos, o uso da espectroscopia de reflectância difusa foi limitado às áreas têxteis, de papel, cerâmica, tintas e pigmentos como técnica analítica de controle de qualidade para avaliar cor, brancura e brilho das superfícies brancas ou coloridas.
Por exemplo, na indústria têxtil, durante a produção de tecidos tingidos, amostras de tecidos são retiradas para avaliar se a tonalidade está sendo mantida, sempre tendo como referência o espectro de reflectância. Na indústria de papel, além da cor, a brancura e brilho também são avaliados (WENDLANDT; HECHT, 1966). A espectroscopia de reflectância difusa foi considerada uma técnica inviável para análises quantitativas, uma vez que não era possível alcançar boa precisão das medidas obtidas a partir de spot tests convencionais (KEALEY, 1972). De acordo com Kealey (1972) as medidas de reflectância obtidas a partir de spot tests convencionais apresentavam precisão relativa entre 10 e 20% e, portanto, resultados quantitativos foram considerados inviáveis. Entretanto, com os avanços tecnológicos na área de dispositivos ópticos, incluindo fibras ópticas e esferas de integração, medidas de reflectância puderam ser obtidas com bons resultados de precisão (GHAUCH et al., 2000;
TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997).
IV. 2.1. Fundamentos
Segundo as teorias discutidas por Wendlant e Hecht (1966) a reflexão da radiação sobre uma superfície pode ser de dois tipos: especular ou tipo espelho e difusa. Para que se possa utilizar a reflectância como técnica analítica é necessário entender os tipos de reflexão.
A reflexão especular ou tipo espelho ocorre em superfícies lisas ou polidas e pode ser definida pela lei de reflexão de Fresnel. Neste tipo de processo os ângulos de incidência e de reflexão são idênticos e não há transmissão da radiação através da superfície (WENDLANT;
HECHT, 1966).
Ao contrário da reflexão especular, a reflexão difusa acontece em superfícies foscas ou opacas e ocorre por reflexões múltiplas a partir das superfícies das partículas que constituem o meio. A reflexão difusa compreende um processo complexo que ocorre quando a radiação penetra em um substrato sólido. Parte desta radiação retorna à superfície do substrato, ocorrendo também dispersão múltipla e absorção parcial da radiação pelas partículas ou fibras que constituem o substrato sólido (WENDLANT; HECHT, 1966).
A reflectância ou poder de reflexão (R) é dada por:
I0
R= I , onde: (Equação 1)
R é o sinal que representa a radiação refletida e que pode ser registrado por detectores, tais como uma fotomultiplicadora ou arranjo de fotodiodos.
0 =
I intensidade da radiação incidente
=
I intensidade da radiação refletida
Os valores de R variam entre 0 e 1 e são normalmente expressos em termos de reflectância percentual R(%), isto é:
100
0
×
= I
R I (Equação 2)
Considera-se R igual a 1 quando o sinal de reflectância é igual ao da radiação incidente, condição que pode ser conseguida utilizando um padrão de reflectância máxima, geralmente pastilhas de BaSO4 e MgO (WENDLANT; HECHT, 1966).
IV. 2.2. Teoria de Kubelka-Munk
Diversos modelos foram desenvolvidos para descrever, em termos quantitativos, a intensidade da radiação refletida difusamente (SKOOG, 2002). A teoria de Kubelka-Munk é o modelo mais aceito que relaciona concentração da amostra e reflectância. Esta teoria descreve a relação entre coeficiente de absorção molar, coeficiente de dispersão e poder de reflectância em um meio semi-infinito (infinitamente fino) de acordo com a seguinte equação:
s k R R R
f = − =
. 2
) 1 ) ( (
2
, onde: (Equação 3)
=
k coeficiente de absorção molar
=
s coeficiente de dispersão
Para amostras diluídas, k está relacionado à absortividade molar (ε) e à concentração (C) pela relação:
C
k =2,303ε. (Equação 4) Para a aplicação adequada da equação de Kubelka-Munk é necessária a determinação da reflectância absoluta do material usado como referência (REINECKE et al., 1988).
Entretanto, a relação linear entre f(R)e concentração somente é observada na prática para substâncias que absorvem fracamente e quando o tamanho das partículas que constituem o meio é relativamente pequeno (1 μm de diâmetro interno) (FREI; MACNEIL, 1973).
Atualmente, diversos gráficos têm sido descritos para análises quantitativas envolvendo transformações matemáticas da variável dependente (sinal) e/ou independente (concentração),
tais como: logR versus C2 −R; R versus [C/(1−C)2]; logR versus 1/C; e R versus C
log (TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997).
Vale mencionar que em análises por espectroscopia de reflectância difusa, o sinal de reflectância pode ser convertido em densidade óptica para medida de reflectância (AR), que é dada por:
) / 1 log( R
AR = (Equação 5)
III. 2.3. Instrumentos
Os instrumentos para medida de reflectância podem ser acessórios acoplados a um espectrofotômetro ou podem ser equipamentos portáteis. Em geral, os instrumentos para medidas de reflectância contêm os seguintes componentes: fonte de luz, suporte para amostra e para padrão branco usado como referência, esfera de integração, espelhos, detector e registrador. A Figura 6 apresenta um esquema de um acessório de reflectância Labsphere, modelo RSA-HP-53.
Figura 6. Vista superior do acessório de reflectância Labsphere modelo RSA-HP-53 Fonte: LABSPHERE. RSA-HP-53 instruction manual. North Sutton, [1999?]. p. 4.
A esfera de integração consiste de uma esfera revestida internamente por uma camada de material altamente refletor. Antigamente, as esferas de integração eram fabricadas com material metálico revestido com tinta branca ou pó de MgO ou de BaSO4 prensado. Os revestimentos utilizados atualmente são materiais brancos de politetrafluoroetileno (PTFE) ou outros termoplásticos (Spectralon®) (STORM; SPRINSTEEN, 2006). As propriedades de reflectância de uma amostra envolvem a determinação da distribuição espacial da radiação refletida, com relação à intensidade e ao estado de polarização. A esfera de integração tem a função de coletar e integrar espacialmente o fluxo de radiação refletida por uma superfície.
Assim, a intensidade da luz refletida em qualquer ponto da esfera corresponde à medida do fluxo total de radiação refletida pela superfície. Desta forma é possível obter o fluxo de luz refletida integrado total, o qual é utilizado para as medidas de reflectância (LABSPHERE, 2006).
Os equipamentos para medidas de reflectância podem apresentar esferas de integração de diferentes tamanhos. Esferas com diâmetro interno maior são mais eficazes na integração da luz e as medidas são mais exatas do que esferas de menor diâmetro interno. Os equipamentos para medidas de reflectância também podem apresentar diferentes geometrias, podendo levar a valores de reflectância diferentes para uma mesma amostra em dois equipamentos com geometrias distintas. Isto ocorre devido a diferenças nos ângulos de incidência e de reflexão, os quais são muito importantes para as medidas da reflectância difusa (WENDLANDT; HECHT, 1966).
IV. 2.4. Representação do espectro de reflectância
Os espectros de reflectância podem ser apresentados de várias maneiras. Os gráficos são comumente obtidos a partir deR(%), f(R)ou AR(log(1/R)em função do comprimento de onda (nm). A Figura 7 apresenta três espectros obtidos a partir de um mesmo equipamento
para medidas de reflectância (acessório Labsphere, modelo DRA-CA-3300) e de um mesmo papel de filtro colorido, sobre o qual ocorreu a reação entre bumetanida e p-dimetilaminocinamaldeído, em meio ácido (POLLO, 2006), sendo que a Figura 7a representa o espectro obtido a partir de (%)R , a Figura 7b o espectro de log (1/R) (AR) e a Figura 7c o espectro de f(R) versus comprimento de onda (nm).
Figura 7. Espectros de reflectância obtidos a partir do produto da reação de spot test entre butenamida e p-dimetilaminocinamaldeído, em meio ácido. As análises foram realizadas utilizando um acessório de reflectância Labsphere, modelo DRA-CA-3300. Concentração de butemanida
= 1,37 × 10-3 mol L-1. Figura 7a. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de %R.
Figura 7b. Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de log(1/R). Figura 7c.
Espectro de reflectância obtido a partir dos valores de f(R)
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
(a)
(b)
(c)
Para compreender as diferenças entre os espectros apresentados na Figura 7, basta converter (%)R em f(R)e em log(1/R), de acordo com as Equações 3 e 5. Desta forma, pode-se entender porque o espectro de R (Fig. 7a) deve apresentar-se invertido em relação aos outros espectros (Fig. 7b e 7c).
III. 2.5. Aplicações da espectroscopia de reflectância difusa para análises quantitativas
Diversos métodos por espectroscopia de reflectância difusa, na região do visível, para análises quantitativas têm sido descritos na literatura (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003;
BEROZA; HILL; NORRIS, 1968; BRADDOCK; MAREC, 1966; DMITRIENKO et al., 2002; FRITZ et al., 2003; FRODYMA; FREI, 1964, 1965, 1969; GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; KEALEY, 1972, 1974, 1976, 1977; KIRK;
MOSS; VALENTIN, 1968; LIEU et al., 1967; LIEU; ZAYE; FRODYMA, 1969; LIEU;
FRODYMA, 1966; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTÍNEZ;
CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ;
CAMPÍNS-FALCÓ, 2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993;
NARAYANASWAMY; SEVILLA III; 1986; NARAYANASWAMY, 1993; OLIVEIRA;
SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHÃES, 1997; TUBINO; SOUZA, 2006;
ZAPOROZHETS; GAWER; SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS et al., 1999;
ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002; ZAYE; FREI; FRODYMA, 1967). O gráfico apresentado na Figura 8 apresenta o resultado de um levantamento realizado, no período de 1960 até 2006, nas principais bases de dados, sobre métodos que empregaram a espectroscopia de reflectância difusa, na região visível do espectro, para análises quantitativas.
Figura 8. Distribuição das publicações de métodos por espectroscopia de reflectância difusa na região do visível para análises quantitativas. Período: 1960-2006.
Podemos observar (Figura 8) que muitos artigos foram publicados na década de 60 e, talvez pela dificuldade em obter resultados com boa precisão naquela época, o número de publicações diminuiu e só voltou a aumentar na década de 90, provavelmente, devido aos avanços tecnológicos e à facilidade de se obter medidas mais precisas, além da preocupação em se desenvolver métodos simples, rápidos e com baixo consumo de reagentes e solventes.
Atualmente, o número de publicações envolvendo a espectroscopia de reflectância difusa na região do visível para análises quantitativas vem aumentando consideravelmente (Figura 8).
Algumas destas análises envolvem a determinação de metais sobre superfície de papel de filtro (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; TUBINO; ROSSI;
MAGALHÃES, 1997).
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Número de publicações
60 70 80 90
2000-2006 Décadas
O método descrito por Tubino, Rossi e Magalhães (1997) foi proposto para a determinação de Fe(III), Cr(VI) e Ni(II). Ghauch et al. (1999) descreveram um método semelhante para a determinação de Co(II), Cu(II), Fe(III) e Ni(II). Fosfato, amônio e Cu(II) também foram determinados por espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot test em papel de filtro (GHAUCH et al., 2000).
A espectroscopia de reflectância difusa associada à extração em fase sólida (EFS) também tem sido descrita na literatura. Gazda, Fritz e Porter (2004b) desenvolveram um método para a determinação de Ni (II) em amostras de água a bordo da Estação Espacial Internacional. Outros métodos utilizando EFS acoplada a espectroscopia de reflectância difusa foram propostos para a quantificação de aminas alifáticas (MOLINER-MARTÍNEZ;
CAMPÍNS-FALCÓ, 2005), iodo (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a) e iodeto, Ag (I), Cu (II), Ni (II), Fe (III), Cr (VI) e outros cátions (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; FRITZ et al., 2003; MOLINER-MARTÍNEZ; HERRÀEZ-HERNANDEZ; CAMPÍNS-FALCÓ, 2005) em amostras de água. Sílica gel impregnada com reagentes analíticos também tem sido associada à espectroscopia de reflectância difusa para a determinação de diversos metais (NADZHAFOVA et al., 2005; ZAPOROZHETS et al., 1999; ZAPOROZHETS; GAWER;
SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).
Além disso, a espectroscopia de reflectância difusa tem oferecido a possibilidade da construção em laboratório de dispositivos portáteis para análises quantitativas (MATIAS;
OLIVEIRA; MOSCHIM, 1997; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003). Um sensor de fibra óptica portátil foi desenvolvido por Matias, Oliveira e Moschim (1997) para analisar a fumaça proveniente de motores de veículos a diesel. O sensor funciona por amostragem da fumaça sobA.62a
ma fita adesiva branca, seguida da medida da luz refletida pela fita
ma005rcada. Um outro dispositivo portátil empregando o fenômeno da reflectância difusa foi desenvolvido para a determinação de Ni (II) em catalisadores (MATIAS; VILA; TUBINO,
2003). O método foi baseado na clássica reação entre Ni (II) e dimetilglioxima, em meio alcalino (NH4OH), a detecção foi realizada por um LDR (light dependent resistor) e a medida da resistência por um multímetro, a qual foi correlacionada com a reflectância.
Recentemente, a espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot test sobre papel de filtro foi empregada para a determinação de alguns fármacos em formulações farmacêuticas (GOTARDO et al., 2004; GOTARDO; PEZZA; PEZZA, 2005; MATIAS;
VILA; TUBINO, 2004; TUBINO; SOUZA, 2006).
O método descrito por Matias, Vila e Tubino (2004) para a determinação de ácido acetilsalicílico envolveu uma reação de complexação do ácido salicílico, obtido a partir da hidrólise alcalina do fármaco, com íons Fe (III). O complexo colorido foi submetido à análise em um reflectômetro homemade, composto por um LED (light emitting diode) e um LDR e medidas de resistência foram obtidas. Um método utilizando um reflectômetro semelhante foi descrito por Tubino e Souza (2006) para a determinação de diclofenaco em formulações farmacêuticas.
Os estudos citados acima revelaram que o uso apropriado da espectroscopia de reflectância difusa forneceu resultados quantitativos confiáveis, demonstrando o potencial desta técnica para análises quantitativas.
Capítulo V. Desenvolvimento de métodos analíticos por
espectroscopia de reflectância difusa utilizando spot
test para a determinação de furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em
formulações farmacêuticas.
V. 1. PARTE EXPERIMENTAL
V. 1.1. Equipamentos
Acessório para reflectância Labsphere RSA-HP-53, contendo esfera de integração (76 mm de diâmetro interno) e lâmpada de tungstênio-halogênio (5W), acoplado a um espetrofotômetro de arranjo de diodos HP-8453A.
Os métodos de referência foram realizados utilizando espectrofotômetro UV-Visível Cary 1E, com cubetas de quartzo de 1,0 cm de caminho óptico.
Estufa com controle de temperatura - Tecnal, Modelo TE-392.
Agitador magnético Corning.
Micropipetas Eppendorf (10 a 100 μL) e Brand (100 a 1000 μL).
V. 1.2. Material e Solventes
Papel de filtro quantitativo Whatman 41 e 42 foram usados como suporte sólido no método para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente. Papel de filtro qualitativo Whatman 42 foi usado nos métodos para a determinação de propranolol e atenolol.
Os excipientes utilizados nos estudos de interferências foram de grau farmacêutico.
Os solventes utilizados nos métodos para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida foram acetona (grau p.a.) e metanol (grau HPLC) (Mallinckrodt, Xalostoc, México). No método para a determinação de atenolol foi usado metanol grau HPLC (J.T.
Baker, Phillipsburg, EUA) e dioxano (grau p.a.) (Tedia, Fairfield, EUA). Os solventes usados no método para a determinação de propranolol foram acetona (grau p.a.), etanol (grau HPLC) (Mallinckrodt, Xalostoc, México) e água desionizada.
V. 1.3. Reagentes e Soluções
Nos métodos para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida, p-dimetilaminocinamaldeído (PDAC) (p.a., Riedel-de haën, Alemanha) foi usado para preparar a solução de PDAC 2,23 × 10-1 mol L-1 em metanol. Esta solução foi mantida refrigerada por, no máximo, uma semana. Soluções de ácido clorídrico 6,3% (m/v) (1,73 mol L-1) e 10% (m/v) (2,75 mol L-1) foram preparadas por diluição adequada do ácido clorídrico concentrado (37%) (p.a., Mallinckrodt, Xalostoc, México) em metanol e empregadas nos métodos para a determinação de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente.
No método para a determinação de atenolol foi utilizado p-cloranil (Sigma, St Louis, EUA) no preparo de uma solução 8,00 × 10-2 mol L-1 em dioxano. Esta solução foi preparada diariamente.
No método para a determinação de propranolol, 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) ou reagente de Gibbs (p.a., Sigma, St. Louis, E.U.A.) foi usado para preparar uma solução 3,33 × 10-1 mol L-1 (70 mg/ml) em acetona. Esta solução foi preparada diariamente.
Solução estoque de furosemida (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de 100,1%, foi preparada na concentração de 1,52 × 10-1 mol L-1 em acetona. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de furosemida em acetona e usadas na construção da curva analítica (7,56 × 10-3 a 6,05 × 10-2 mol L-1).
Solução estoque de hidroclorotiazida (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de 99,85%, foi preparada na concentração de 1,68 × 10-1 mol L-1 em acetona. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de hidroclorotiazida em acetona e usadas na construção da curva analítica (3,36 × 10-2 a 1,01 × 10-1 mol L-1).
Solução estoque de propranolol (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de 99,80%, foi preparada na concentração de 1,68 × 10-1 mol L-1 em solução de etanol 35% (v/v) em água. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de
propranolol em etanol 35% (v/v) e usadas na construção da curva analítica (1,35 × 10-2 a 8,45
× 10-2 mol L-1).
Solução estoque de atenolol (Purifarma, São Paulo, Brasil), grau de pureza de 99,90%, foi preparada na concentração de 2,25 × 10-1 mol L-1 em metanol. Soluções padrão foram obtidas a partir de diluições da solução estoque de atenolol em metanol e usadas na construção da curva analítica (1,13 × 10-2 a 7,88 × 10-2 mol L-2).
Todas as soluções estoque foram preparadas no momento do uso.
V. 1.4. Amostras
As amostras comerciais das formulações farmacêuticas (comprimidos) analisadas foram obtidas em farmácias locais e analisadas dentro dos seus prazos de validade.
O número de marcas comerciais de formulações farmacêuticas analisadas para cada um dos fármacos estudados e o conteúdo de fármaco declarado pelo fabricante em cada comprimido estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Número de marcas comerciais de formulações farmacêuticas analisadas em cada método desenvolvido e conteúdo declarado de fármaco por comprimido.
Furosemida Hidroclorotiazida Propranolol Atenolol
Nº Marcas Analisadas 6 6 6 5
Conteúdo Declarado (mg/comprimido)
40 50 40 25, 50 e 100
V. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
V. 2.1. Spot test
Para a realização dos spot tests, as soluções foram adicionadas sobre a superfície de papel de filtro, cortado em quadrados com área de, aproximadamente, 2 cm2. O papel foi colocado na parte inferior de um suporte (Figura 9), de acordo com o procedimento descrito por Tubino, Rossi e Magalhães (1997) com o auxílio de uma pinça. As soluções foram adicionadas no centro do papel de filtro utilizando uma micropipeta adaptada ao suporte.
Figura 9. Suporte utilizado na realização dos spot tests (Baseado em: TUBINO; ROSSI;
MAGALHÃES, 1997).
A seguir são descritos os procedimentos para a realização dos spot tests em cada método desenvolvido:
Furosemida:
Inicialmente, 10 μL da solução contendo o fármaco foram adicionados sobre a superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de HCl (6,3%, m/v) e de 20 μL da solução de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. Em seguida, o papel de filtro foi aquecido a 80ºC por 5 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento foi necessário para a formação do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 585 nm.
Hidroclorotiazida:
Inicialmente, 20 μL da solução contendo o fármaco foram adicionados sobre a superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de HCl (10%, m/v) e de 20 μL da solução de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. O papel de filtro foi então aquecido a 80ºC por 8 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento foi necessário para a formação do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 585 nm.
Propranolol:
Inicialmente, 30 μL da solução contendo o fármaco foram adicionados sobre a superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 30 μL da solução de DCQ (3,33 × 10-1 mol L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 500 nm.
Atenolol:
Inicialmente, 20 μL da solução contendo o fármaco foram adicionados sobre a superfície do papel de filtro, seguidos da adição de 20 μL da solução de p-cloranil (8,00 × 10-2 mol L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectância difusa em 550 nm.
V. 2.2. Preparação das Amostras
Em todos os métodos desenvolvidos, vinte comprimidos (do mesmo lote), de cada uma das amostras comerciais estudadas, foram pesados em balança analítica e finamente triturados em gral de ágata. O valor da massa de um comprimido foi expresso como a média de 20 determinações, com variação menor que 2% (FARMACOPÉIA..., 1988).
Quantidades de amostra equivalentes a 100, 150, 80 e 120 mg de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram pesadas com precisão de 0,0001 g e submetidas à agitação com o solvente adequado (acetona para furosemida e hidroclorotiazida; etanol 35% (v/v) para propranolol e metanol para atenolol) em um agitador magnético por 10 minutos. Após a agitação, as soluções foram adicionadas em balões volumétricos de 10,00 mL e o volume foi completado com o solvente adequado. Alíquotas destas soluções foram retiradas para a realização dos spot tests, conforme descrito no item V.2.1. O branco contendo apenas o solvente e os reagentes foi utilizado como referência e analisado nas mesmas condições.
V. 2.3. Estudo de Interferências
Uma vez que o objetivo deste trabalho foi determinar o fármaco (furosemida, hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol) em formulações farmacêuticas (comprimidos), o efeito dos excipientes mais comumente utilizados foi cuidadosamente avaliado.
Em todos os métodos desenvolvidos, os excipientes estudados foram amido, talco, lactose, estearato de magnésio, etilcelulose, dióxido de silício e croscarmelose sódica. No método para a determinação de atenolol foram ainda estudados os excipientes lauril sulfato de sódio e celulose microcristalina.
O procedimento para o estudo de interferências, em todos os métodos desenvolvidos, é descrito a seguir:
Uma determinada quantidade de fármaco (50, 120, 80 ou 120 mg de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol, respectivamente) e cada um dos excipientes, separadamente, em quantidade igual e dez vezes maior à de fármaco foram submetidos ao procedimento descrito no item V. 2.2.
V. 2.4. Estudo de Adição e Recuperação
Em todos os métodos desenvolvimentos foi realizado um estudo de adição e recuperação de fármaco padrão, o qual envolveu o seguinte procedimento:
Às amostras contendo massa equivalente a 50, 100, 80 e 60 mg de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram adicionadas quantidades de fármaco padrão, de forma a se obter soluções com concentrações finais que abrangessem a faixa de linearidade da curva analítica (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). Para todos os métodos, as quantidades adicionadas de fármaco padrão corresponderam a 50, 100, 150 e 200% da massa de fármaco presente na amostra. Ao béquer contendo amostra e fármaco padrão foi adicionado o solvente adequado, seguindo o procedimento descrito no item V. 2.2.
A Tabela 8 apresenta as quantidades - em massa (mg) e em concentração final (mol L-1) - de fármaco padrão adicionado nas amostras.
Tabela 8. Quantidades adicionadas de fármaco padrão dadas em mg e em concentração (mol L-1).
Quantidades adicionadas de fármaco padrão Fármaco
(mg) (mol L-1)
Furosemida 25 50
75 100
7,56 × 10-3 1,51 × 10-2 2,27 × 10-2 3,02 × 10-2
Hidroclorotiazida 50
100 150 200
1,68 × 10-2 3,36 × 10-2 5,04 × 10-2 6,72 × 10-2
Propranolol 40
80 120 160
1,35 × 10-2 2,70 × 10-2 4,05 × 10-2 5,40 × 10-2
Atenolol 30
60 90 120
1,13 × 10-2 2,25 × 10-2 3,38 × 10-2 4,50 × 10-2
V. 2.5. Determinação de peróxido de hidrogênio em dioxano: método modificado No desenvolvimento do método reflectométrico para a determinação de atenolol foi realizada a quantificação de peróxido de hidrogênio no dioxano utilizado como solvente para o p-cloranil. Para tal, foi inicialmente empregado o método espectrofotométrico descrito por Benatsky e Tomik (1988) para determinação de peróxidos em solventes orgânicos, o qual é baseado na reação de peróxido com metavanadato de amônio e ácido nítrico concentrado, formando um composto colorido (λ máx. = 450 nm) (BENATSKY; TOMIK, 1988). Entretanto, durante o emprego do método observou-se que a etapa de extração descrita não era necessária, uma vez que o dioxano e a solução contendo metavanadato de amônio misturaram-se de forma homogênea. Além disso, a quantidade de peróxido na amostra de dioxano não era conhecida. Desta forma, a quantificação foi realizada pelo método das adições de padrão e com algumas modificações no método descrito na literatura (BENATSKY; TOMIK, 1988), como segue:
A solução reagente foi preparada a partir da dissolução de 0,6250 g de metavanadato de amônio em 3,75 mL de ácido nítrico concentrado. O volume foi completado com água desionizada em balão volumétrico de 25,00 mL. A 5,00 mL de amostra de dioxano foram adicionados individualmente 0,50, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 mL de uma solução padronizada de peróxido de hidrogênio (2,37 × 10-2%, m/m). Em seguida, adicionou-se 10,00 mL da solução de reagente e o volume foi completado para 25,00 mL em balão volumétrico. As soluções foram analisadas por espectrofotometria em 450 nm.
V. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
V. 3.1. Determinação de furosemida em formulações farmacêuticas V. 3.1.1. Spot test
O método proposto foi baseado em medidas de reflectância, na região visível do espectro, do composto violeta formado a partir da reação entre furosemida e PDAC, em meio ácido (HCl). A reação ocorreu sobre superfície de papel de filtro, após aquecimento a 80ºC por 5 minutos. A Figura 10 apresenta o espectro de reflectância com valor máximo de AR em 585 nm.
Figura 10. Espectro de reflectância do produto formado na reação entre furosemida e PDAC, em meio ácido, após aquecimento a 80ºC por 5 min. O comprimento de onda máximo foi 585 nm.
Solução padrão de furosemida: 3,78 × 10-2 mol L-1.
O PDAC tem apresentado um amplo uso como reagente cromogênico em análises espectrofotométricas de diversos compostos, tais como: uréia, tiouréia e seus N-alquil/aril derivados (HUSSAIN; SHAUKAT, 2002), aceclofenaco (ZAWILLA et al., 2002), diclofenaco de sódio (EL-SHERIF et al., 1997), oxifenbutazona (SAEED; HAQUE;
400 500 600 700 800
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
AR
Comprimento de onda (nm)
QURESHI, 1993), glafenina e metoclopramida (MOUSSA, 2000). O PDAC também tem sido usado para análises, em micro-placas, de ácido p-aminohipúrico em amostras de plasma e urina (AGARWAL, 2002) e para testes rápidos de benzodiazepinas em medicamentos (LAUDSZUN; KOVAR, 1991). A maioria dos métodos mencionados acima envolve reação em meio ácido com aquecimento, produzindo compostos coloridos (variando de laranja a vermelho ou rosa).
O PDAC também foi descrito na literatura para a determinação espectrofotométrica de furosemida (SHIMDDA; NAGASE, 1977). Uma provável reação entre aminas secundárias aromáticas e PDAC envolve a condensação do grupo amino secundário protonado com o grupo carbonila do reagente, formando um sal imínio ou base de Schiff (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000). A reação apresentada no Esquema 1 foi baseada em reações entre outras aminas secundárias aromáticas e PDAC descritas na literatura (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000).
Esquema 1
Um fato interessante no método para a determinação de furosemida foi que a cor do spot test obtido a partir da adição da solução de furosemida, PDAC e HCl, nesta ordem, foi mais intensa nas bordas do que no centro da mancha formada. Observou-se também que quando a solução de reagente foi adicionada por último, a cor do spot test foi mais uniforme e muito mais intensa.
Sal Imínio
Cl
H2NO2S
NH CH2
COOH O
H+
CH2 O Cl
H2NO2S COOH NH2 +
+
CH3 Ch3 CH
OCH CH N
Rápido
Cl
H2NO2S COOH CH2 O
NH C CH CH N
CH3 CH3
+ HO +
H
Rápido
+
NH CH2 O Cl
H2NO2S COOH
De acordo com Wendlandt e Hecht (1966) a cor do spot test deve ser uniforme sobre toda a superfície sólida para se obter melhor precisão das medidas de reflectância. Neste sentido, cabe ressaltar que para a elaboração dos spot tests envolvidos em todos os métodos desenvolvidos neste trabalho levou-se em consideração alguns detalhes, tais como: ordem e velocidade de adição das soluções, qualidade do papel de filtro utilizado e volume das soluções adicionadas. Todos estes detalhes mostraram ser importantes para a uniformidade da cor do spot test e, conseqüentemente, para a obtenção de boa precisão das medidas de reflectância.
V. 3.1.2. Planejamento Fatorial de Experimentos
Estudos foram realizados para estabelecer as condições mais favoráveis para a reação entre furosemida e PDAC, em meio ácido (HCl), visando alcançar a intensidade máxima da cor do spot test, sobre papel de filtro, em 585 nm. Uma vez que a necessidade de aquecimento para o desenvolvimento da cor foi observada, os fatores inicialmente estudados foram tempo e temperatura de aquecimento. Utilizando um planejamento fatorial de 2 níveis em torno das condições utilizadas para a reação em testes preliminares (10 μL de solução de furosemida 3,02 × 10-2 mol L-1, 10 μL de solução de HCl 6,3%, m/v, 10 μL de solução de PDAC 0,4%
m/v e aquecimento à aproximadamente 70ºC por 3 minutos) foi possível variar os dois fatores (tempo e temperatura de aquecimento) simultaneamente. A partir dos resultados obtidos neste planejamento, foi realizado um planejamento de modo similar, no qual os fatores avaliados foram volumes adicionados de PDAC e de HCl. Desta forma, os valores de AR (respostas) obtidos com volumes fixos das soluções de furosemida, PDAC e de ácido adicionados foram otimizados em função do tempo e da temperatura de aquecimento. Do mesmo modo, para tempo e temperatura de aquecimento e volume de furosemida fixos, as respostas (AR) foram otimizadas em função dos volumes adicionados de PDAC e de ácido. As condições avaliadas